В природе микроорганизмы постоянно сталкиваются с изменениями окружающей среды (отсутствие питательных веществ, высушивание, быстрое изменение температур и т. д.). Для того чтобы выжить в этих условиях, микроорганизмы используют сложные системы быстрой оценки состояния окружающей среды, позволяющие своевременно ее контролировать и обеспечивать себе максимальный рост и выживаемость.

Для многих микроорганизмов источником питания является растительная и животная ткань. Однако живые растения и животные обладают многочисленными механизмами, защищающими их от внедрения микроорганизмов (например, целлюлозные стенки растительных клеток, бактерицидные масла и фенольные субстанции растений, продукты метаболизма и антимикробные субстанции — лизоцимы, пероксидаза животных клеток). Сюда также включаются специфические механизмы, нейтрализующие бактерий, такие как производство фитоалексинов растениями и антител — животными.

С одной стороны, когда животные или растения погибают или используются человеком в качестве сырья для пищевых продуктов, многие антимикробные системы разрушаются или становятся неэффективными. Например, с наступлением смерти животного происходит быстрое прекращение функционирования иммунной системы и фагоцитоза. С другой стороны, большинство низкомолекулярных антимикробных субстанций растений (например, компоненты трав и специй) и животных белков (например, лизоцим, лактопероксидаза, трансферрины и т. д.) могут сохраняться и проявлять свою активность даже в готовом пищевом продукте. Эти их свойства широко используются в пищевой промышленности. Так, лизоцим, полученный из яичного белка, применяется при кзготовлении сыров типа Гауда для предотвращения роста в них Clostridium tyrobutyricum.

Большинство пищевых продуктов, которые предназначены для хранения, подвергают соответствующим обработкам (проваривание, консервирование, замораживание и многие другие), чтобы предотвратить или резко замедлить в них микробный рост. Перечисленные выше обработки вызывают стрессы у микроорганизмов, которые могут быть летальными или частично повреждающими микробную клетку.

Хотя в течение многих лет было известно, что микробные клетки в состоянии стресса подвергаются морфологическим и физиологическим изменениям, только недавно стали понятны некоторые их механизмы. Особый вклад в их расшифровку внесли Baird-Parker с соавторами и многочисленные международные исследования в этой области, обобщенные в монографиях Международной Комиссии по микробиологической спецификации пищевых продуктов.

 

ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ПИЩЕВОГО ПРОДУКТА НА МИКРООРГАНИЗМЫ

Известно, что пищевые продукты являются комплексной смесью белков, пептидов, аминокислот, углеводородов, жиров, витаминов, минералов и воды. По своей природе они имеют животное или растительное происхождение. Многие современные продукты являются смесью натуральных пищевых компонентов с измененной структурой и представляют новое поколение пищевых изделий (например, рыбные палочки, искусственные кремы и маргарины).

Большинство тканей здоровых животных и растений практически стерильны за счет факторов, указанных ранее. Однако в пищевые продукты могут попадать микроорганизмы, живущие на поверхности растений, тела или желудочно-кишечного тракта животных. Контаминация пищевого сырья может иметь место в процессе убоя животных, сбора урожая, в процессе изготовления и хранения продуктов. Природа микробной флоры пищевого продукта, которая развивается в процессе его хранения, будет зависеть от многочисленных факторов, среди которых наиболее важными являются следующие:

  • состав и строение пищевого продукта (например, белковый или углеводный);
  • окружающая продукт атмосфера и температура хранения, рН и содержание воды (водная активность — αw);
  • состав добавленных консервантов и их количество.

Микробная флора может изменяться в зависимости от технологического процесса изготовления продукта. Например, в мягких сырах (таких как камамбер) исходное кислое значение рН, зависящее от роста молочнокислых бактерий, меняется на поверхности сыра в щелочную сторону из-за размножения на ней в процессе хранения Penicillium сатemberti. В итоге на поверхности подобного сыра создаются благоприятные условия для развития таких возбудителей эмерджентных пищевых зоонозов, как Listeria monocytogenes и Е. coli 0157:Н7. Однако в его толще, где сохраняется кислое значение рН, эти бактерии могут лишь выжить, но не размножаться.

Как внутри продуктов, так и на их поверхности микроорганизмы существуют в виде сообществ, что подтверждено многочисленными данными. При этом микроорганизмы в данных сообществах обладают способностью взаимодействовать друг с другом и с окружающей средой. Одним из примеров этого общения является производство конъюгативных плазмид и транспозонов, переносящих генетическую информацию от одной микробной клетки к другой, например устойчивость к антибиотикам. Другой пример, полученный при изучении покровов (биопленок) бактерий, показал, что микроорганизмы вырабатывают сигнальные молекулы, информирующие их о необходимом сотрудничестве при формировании комплексных биологических структур будущего покрова. Вероятно, что подобная связь и сообщение между клетками используется микроорганизмами, попавшими в пищевые продукты.

Рассматривая вопрос воздействия окружающей среды на рост и выживаемость бактерий, необходимо иметь в виду, что в любом пищевом продукте существует разнообразие микросред, каждая из которых может влиять на рост и выживаемость клеток в конкретной части пищевого продукта. Действие этой микросреды будет зависеть от свойств микроорганизма, его физиологического статуса (например, клетки, находящиеся в лаг-фазе, всегда более устойчивы, чем в лог-фазе развития) и от ответной реакции клеток на данное воздействие окружающей среды.

 

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ

Микроорганизмы, выращенные при максимально возможных для их роста температурах, обладают более выраженной термоустойчивостью. Например, D601 для штаммов стафилококка, выращенных при 37 °С и попавших в различные пищевые продукты, варьирует от 2,5 до 3,1 мин. Если же эти штаммы выращивать при температуре 43 °С, то их устойчивость (в тех же пищевых продуктах) возрастает до 12,2-14,7 мин.

Если же микроорганизмы подвергнуть краткосрочному (от 30 мин до 2 ч) сублетальному температурному воздействию («тепловому шоку»), то их термоустойчивость может вырасти от 2 до 100 крат. При этом, кривая выживаемости бактерий, подвергнутых «тепловому шоку» резко отличается от контрольной. Например, число выживших клеток Salmonella typhimurium, прогретых при температуре 57 °С, уже через 10 мин сокращается на 106, в то время как число клеток сальмонелл, предварительно подвергнутых «тепловому шоку» снижается лишь в 10 раз.

Важность данного адаптационного механизма бактерий для практических условий, в которых осуществляется пастеризация и стерилизация пищевых продуктов, не столь очевидна, так как указанные термообработки происходят на практике довольно быстро и тем самым исключают возможность адаптации. Однако некоторые медленные процедуры, связанные с коммерчески приготавливаемыми продуктами, например ветчины, когда температура продукта поднимается не более 0,7 °С в минуту, может оказать на бактерии эффект «теплового шока» и значительно увеличить их термоустойчивость. Подобное явление отмечено и при медленной проварке говядины, искусственно инфицированной сальмонеллами. При этом, показатель D50 для данных бактерий в процессе приготовления говядины возрастает от 30 до 80 мин.

На термоустойчивость вегетативных клеток бактерий влияет температура хранения контаминированного продукта до и после термообработки. Так, D60 для Salmonella enteritidis (фаготип 4) в сырых яйцах, хранившихся при температуре 41 °С в течение 14 ч, составила 0,47 мин, а для яиц, хранившихся при 4 °С в течение 4 ч, — 0,06 мин, т. е. в 7,8 раз меньше. Однако если эти яйца помещали в камеру при 30 °С, бактерии восстанавливали свою термоустойчивость в течение 30 мин.

Адаптация бактерий к высокой температуре является фенотипической реакцией, которая довольно быстро (в течение 24 ч) исчезает при удалении вызвавшего его фактора. Хотя механизмы этого явления не достаточно выяснены, полагают, что большую роль в адаптации играют «протеины теплового шока». В данном случае следует отметить, что те же белки ответственны за устойчивость бактерий к кислотам. Это может иметь большое практическое значение при использовании медленно пастеризованных пищевых ингредиентов в подкисленных или ферментированных продуктах либо при использовании комбинации подогретых органических кислот, применяемых для деконтаминации поверхности туш.

В отличие от описанных выше факторов, стимулирующих устойчивость клеток, выращенных при максимально высоких температурах, бактерии, инкубированные при температурах ниже оптимальных для их роста, являются менее термостойкими. Имеются сведения о трехкратном снижении термоустойчивости клеток стафилококка, выращенных при 19 °С, по сравнению с клетками, выращенными при 37 °С.

Когда на микроорганизмы воздействуют низкие температуры, их ответной реакцией является повышение питательных потребностей и увеличение пропорции ненасыщенных жирных кислот в клеточных мембранах. Это важно для функционирования мембран при низких температурах. Краткосрочное воздействие на клетки температур, используемых для быстрого охлаждения мяса (5-10 °С) приводит к увеличению устойчивости сальмонелл к последующему замораживанию. Это связано с образованием «протеинов холодового шока», позволяющим бактериям выживать при резком спаде температуры. Указанные белки вырабатываются различными видами микроорганизмов, включая Е. coli.

Важно отметить, что у бактерий, выращенных при низких температурах, происходит изменение последующей лаг-фазы. Так, у L. monocytogenes, выращенных при 4 °С, лагфаза при 0 °С колеблется от 3 до 18 дней, а у клеток, выращенных при 30 °С, — от 13 до 30 дней. Еще более выраженная разница обнаружена у клеток психротрофных бактерий — Aeromonas hydrophilia. Так, лаг-фаза при 0 °С для клеток, предварительно выращенных при 5 °С, составила 12,3 ч, а при 37 °С —353,7 ч (более чем в 28 раз).

Таким образом, присутствие адаптированных к холоду клеток в пищевых продуктах может существенно повлиять на сокращение сроков их хранения в охлажденном состоянии. Поэтому, с практической точки зрения, следует избегать долгосрочного холодильного хранения пищевого сырья и продуктов из-за возможности их контаминации адаптированными к холоду бактериальными клетками из окружающей среды производственных зон, например холодильных цехов, где осуществляется охлаждение пищевых продуктов.

Когда пищевые продукты подвергаются замораживанию, происходит значительное удаление воды, и микроорганизмы оказываются как бы в обезвоженной окружающей среде. В незамерзшей части растворов происходит повышение их концентрации, что в конечном счете приводит к повышению осмотического давления и снижению водной активности (aw). Поэтому воздействие замораживания на микроорганизмы можно рассматривать как эффект комбинации воздействия низких температур и понижения aw.

Устойчивость бактерий к замораживанию, как указано ранее, зависит от предварительных условий хранения, а также от скорости замораживания и конечной температуры. В целом можно утверждать, что чем выше скорость замораживания и ниже окончательная температура хранения, тем выше выживаемость бактерий. Замораживание сопровождается различными процессами в клетке, главными из которых являются дегидратация и снижение показателя aw.

При низких температурах хранения пищевых продуктов (-18 °С) у микроорганизмов нет возможности развивать адаптационные или восстановительные механизмы (последние начинают функционировать при размораживании).

В процессе замораживания происходит травмирование цитоплазматической мембраны, что приводит к нарушению ее функций (утечка катионов, аминокислот и других важных компонентов цитоплазмы.). В то же время клетки теряют способность нейтрализовать потенциально токсические для них вещества из внешней среды. Этим, в частности, объясняется повышенная чувствительность частично травмированных клеток к ингредиентам дифференциальных сред (например, кишечной палочки и сальмонелл — к питательным средам, содержащим желчные кислоты).

Устойчивость микроорганизмов к замораживанию-оттаиванию обычно выше при нейтральных рН среды, высоком содержании в ней жира и белка, чем при низком рН и преобладании углеводов. Полагают, что наличие жира и белка способствует восстановлению важных составляющих поврежденных клеточных мембран. В продуктах с низким уровнем рН, а также содержащих антибактериальные вещества, происходит нарушение проницаемости цитоплазматической мембраны, что позволяет потенциально опасным ионам и молекулам проникать вглубь клетки.

Изменение температуры окружающей среды может влиять и на микробную вирулентность. Так, перемещение бактерий из низких температур в температурный диапазон теплокровных животных может привести к формированию клетками детерминант вирулентности, таких как пили, капсулярный материал и специфические факторы вирулентности. Примером формирования специфического фактора вирулентности при воздействии высоких температур является производство листериолизина, которое имеет место при воздействии на клетки листерий термического шока или окислительного стресса.

Детерминанты вирулентности кишечной палочки также изменяются при температурном воздействии. Возрастание кислотоустойчивости Е. coli 0157:Н7 вследствие температурного шока может существенно увеличить потенциал выживаемости этих бактерий не только в продуктах с высокой кислотностью, но и в желудочном соке, поэтому рассматривается как фактор, увеличивающий вирулентность.

Таким образом, ответные реакции микробной клетки на различные стрессы могут создавать проблемы в сфере безопасности пищевых продуктов, хотя следует помнить, что они являются краткосрочными фенотипическими реакциями.

 

ВЛИЯНИЕ НА КЛЕТКИ УМЕНЬШЕНИЯ АКТИВНОСТИ ВОДЫ

Во многих пищевых продуктах снижение водной активности (aw) достигается путем высушивания. Есть также некоторые продукты, копченные с добавлением солей или продукты, консервированные путем добавления сахара, а также «полувлажные» продукты, где снижение aw достигается путем добавления в них растворов с низким молекулярным весом (поваренной соли, лактата натрия, сахарозы, глюкозы или глицерина).

Одним из главных факторов, позволяющим микроорганизмам выживать и размножаться в пищевых продуктах при низких значениях активности воды окружающей среды, является возможность клетки накапливать один или более «родственных растворов» (например, пролина, глютамина, трегалозы и т. д.). Они позволяют избежать потери воды из клетки за счет осмоса, который регулирует тургор давления мембраны и позволяет поддерживать метаболические процессы. Например, раствор карнитина, который присутствует в многочисленных продуктах, действует как осмотический протектор для листерий, позволяя им расти при высоких концентрациях поваренной соли.

Хотя активность среды является надежным общим показателем возможного роста микроорганизмов в продуктах, следует помнить о том, что различные растворы химических веществ при одном и том же значении aw могут существенно влиять на этот процесс. Это так называемый эффект специфических растворов. Так, S. aureus при оптимальных температурах может расти в аэробных условиях в присутствии поваренной соли при показателе aw не ниже 0,86, а в присутствие глицерина этот микроорганизм может расти при aw не ниже 0,89. Противоположный эффект данные химические вещества оказывают на рост CI. hotuli-пит. В присутствии поваренной соли показатель aw для этого микроорганизма должен быть не ниже 0,95, а в присутствии глицерина — 0,93.

Влияние активности воды на выживаемость бактерий — явление комплексное, зависящее от многих факторов, включая состав пищевого продукта, температуру, рН и состав атмосферы, окружающей продукт. Например, выживаемость стафилококка в сухих продуктах увеличивается при уменьшении водной активности до 0,37. При этом она возрастает при анаэробных условиях и при нейтральном значении рН.

В целом микроорганизмы лучше выживают при показателях aw значительно меньших тех, которые необходимы для их роста. Если указанные показатели лишь незначительно ниже минимальных, то скорость отмирания бактерий во время хранения резко возрастает. Это приводит к интересному феномену «самостерилизации», когда изменяется микробный пейзаж пищевого продукта. При этом, происходят отмирание вегетативных клеток, прорастание спор и в дальнейшем их гибель, так как они не могут сформировать жизнеспособные клетки. Этот эффект был отмечен у плесеней и вегетативных клеток бактерий в мясных продуктах и фруктах, а также в пастеризованных мясных продуктах в отношении спор клостридий и Bacillus.

Термоустойчивость бактерий также может зависеть от способов, которые использовались для снижения активности воды. Так, когда aw уменьшается путем использования растворов, повышающих проницаемость клетки (например, глицерина или поваренной соли), не отмечается резкого повышения термоустойчивости клеток при показателе aw ниже 0,9. Однако если использовать растворы, которые не повышают проницаемость мембраны (например, сахарозы), то можно наблюдать значительное повышение термоустойчивости, даже при незначительном уменьшении aw. Скажем, D60 в растворе сахарозы для S. bedford при показателе aw 0,98 составляет до 4 мин, а при aw 0,94 — до 32 мин. В тоже время, при тех же условиях, но в растворе поваренной соли, устойчивость сальмонелл значительно меньше и составляет 0,68 и 1,3 мин соответственно.

При использовании растворов различных Сахаров, снижении активности воды до 0,8 клетки сальмонелл способны увеличить термоустойчивость в 1000 раз. Подобный эффект был также продемонстрирован на дрожжах и других грибках. Поэтому в некоторых пищевых продуктах с низким содержанием воды микроорганизмы могут обладать высокой термоустойчивостью. Например, в молочном шоколаде S. typhimurium может выдержать прогревание при 80 °С до 222 мин, S. aureus в растительном масле выживает до 6 мин при температуре 120 °С.

 

УМЕНЬШЕНИЕ РН

Органические кислоты, их соли и эфиры, широко распространенные в природе, используются на практике для консервирования продуктов. В виде растворов они в целом наиболее эффективны как антимикробные агенты, которые проникают через цитоплазматическую мембрану бактерий, насыщая клетку катионами, что в конечном счете приводит к окислению ее клеточного содержимого. При этом микроорганизмы более чувствительны к органическим кислотам, чем неорганическим, так как первые менее диссоциируют. Редким исключением из этого правила является Е. coli 0:157, которая менее чувствительна к молочной кислоте, чем к соляной, что, вероятно, позволяет ей выживать в ферментированных продуктах. Устойчивость бактерий к кислотам связывают с возможностью клетки удалять излишки катионов и тем самым поддерживать рН содержимого цитоплазмы без особых изменений. Увеличение устойчивости клеток к кислотам путем их контактирования с малыми концентрациями является фенотипической ответной реакцией многих микроорганизмов. Она может привести к развитию возрастающей способности клетки удалять излишки катионов или ограничивать их проницаемость вглубь клетки. Возрастание устойчивости грибков к органическим кислотам является, в частности, проблемой для промышленности, перерабатывающей фрукты и производящей безалкогольные напитки. Повышенная кислотоустойчивость была выявлена у некоторых патогенных бактерий, включая L. monocytogenes, Е. coli, S. typhimurium. Причем клетки с приобретенной кислотоустойчивостью могут выживать в продуктах значительно дольше, чем неадаптированные бактерии.

Приобретенная кислотоустойчивость может возрасти при кратких экспозициях клетки с кислотой в низких, не смертельных концентрациях либо путем голодания или после теплового воздействия. Вероятно, что кислотоустойчивые особи лучше выживают в желудочном соке, поэтому они могут вызвать пищевую токсикоинфекцию в меньшей дозе.

 

СОСТАВ ПИЩЕВОГО ПРОДУКТА

С одной стороны, натуральные продукты питания содержат многочисленные ингибиторы бактерий, которые влияют на их рост и выживаемость. С другой стороны, добавление некоторых пищевых ингредиентов может стимулировать их рост: например, добавление соевого белка к мясу способствует росту CL. perfringens. Некоторые натуральные пищевые ингредиенты способствуют выживаемости микроорганизмов. Так, лизоцим способствует восстановлению спор CI. perfringens и CI. botulinum при «тепловом шоке», а карнитин защищает микробные клетки от осмотического шока.

Пищевые продукты с большим содержанием жира также могут оказывать защитное воздействие на бактерии, предохраняя их от губительного воздействия желудочного сока. Поэтому инфекционная доза патогенных микроорганизмов в присутствии жира может быть в 1000 раз меньшей, чем в чисто белковой пище.

Некоторые пищевые продукты создают благоприятные условия для передачи между бактериальными клетками генетической информации. Это хорошо продемонстрировано недавними исследованиями по изолированию антибиотикоустойчивой плазмиды у штамма Lactococcus lactis, выделенного из сыра, приготовленного из сырого молока. Плазмида содержала генетическую информацию, приобретенную от L. monocytogenes, S. aureus, Enterococcus faecium, E.faecalis.

 

ОСНОВНЫЕ ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ КЛЕТКИ НА СТРЕСС

Как было сказано ранее, вегетативные клетки бактерий в пищевых продуктах реагируют на различные стрессы окружающей их среды. Это может иметь значение для безопасности пищевых продуктов. Зачастую в микробной клетке имеют место механизмы, основанные на активации энзимов или на изменении метаболических процессов, которые протекают в течение нескольких секунд или минут. Наиболее важные реакции на стресс вовлекают повреждение транскрипции и экспрессии новых генов и протекают в течение нескольких минут и даже часов. Реакции, связанные с передачей генов между клетками и селекцией внутри сообщества микроорганизмов, протекают еще медленнее. Для достижения существенных результатов требуются месяцы и даже годы.

Среди наиболее быстрых реакций клетки на изменение осмотического состояния окружающей бактерии внешней среды являются реакции каналов клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, ответственные за проход молекул воды и ионов. Подобные каналы характерны для клеток прокариотов и эукариотов и открываются, когда их тургор значительно возрастает, например при неожиданном изменении давления внутри или в связи с осмотическим шоком. Они, вероятно, тем самым позволяют выйти воде из цитоплазмы, уменьшить внутриклеточное давление и избежать травмы клетки, включая разрыв клеточной или цитоплазматической мембраны. Важность этих каналов можно проиллюстрировать тем фактом, что даже внутри одного вида бактерий существует несколько типов каналов, отвечающих за указанные выше процессы. У Е. coli их, по крайней мере, три, они отвечают за различные пороги давления в клетке и за различную проходимость.

Раскрытие наиболее широких по диаметру каналов позволяет малым молекулам, включая сахара, аминокислоты и ионы, выйти из клетки, а макромолекулы при этом остаются в цитоплазме. Наподобие этому с включением определенных систем, происходит специфическая утечка из клеток ионов К+ в ответ на резкое понижение осмотического давления у энтеропатогенных бактерий.

У микроорганизмов, используемых для ферментации пищевых продуктов путем понижения рН, биохимические реакции протекают в течение нескольких минут. При этом клетки сохраняют способность поддерживать без изменений рН их внутренней среды за счет увеличения выхода катионов, катализируемого повышением уровня АТФ-азы мембраны. Когда значения рН меняются очень быстро, происходит краткосрочное снижение рН внутри клетки, но постепенно оно приходит в норму благодаря активизации процесса выхода катионов. При этом имеет место синтез новых белков в наружной мембране клеточной стенки, например у Enterococcus faecalis, что требует по времени десятки минут. Подобное отмечено и у Е. coli 0157 :Н7, подвергнутых тепловому шоку. В этом случае требуется около 10 мин для синтеза белков наружной мембраны клеточной стенки, вовлеченных в транспорт Н+ и ответственных за повышение кислотоустойчивости бактерий после теплового шока.

Наиболее важной ответной реакцией клетки на уменьшение водной активности и увеличение осмотичности является активация «осморегулирующих» механизмов. Эти механизмы включают новые свойства экспрессии гена с последующей стимуляцией сигма-факторов кривой стационарной фазы роста микроорганизмов (например, тех, которыеконтролируются RpoS-геном у некоторых грамотрицательных бактерий). Данные факторы контролируют экспрессию различных генов, обеспечивающих клетке выживание при стрессе.

В результате осморегулирования происходит синтез транспортных протеинов в мембране и синтез или транспорт в клетку из окружающей ее среды компонентов цитоплазмы из «родственных» растворов (бетаин и др.), описанных выше.

Синтез «белков теплового шока», происходящий при сублетальных термических воздействиях на клетку и способствующий повышению термоустойчивости, является широко распространенным явлением для про- и эукариотов. Реакции клетки, связанные с изменением транскрипции и синтезом более 20 новых белков, обычно протекают в течение десятков минут или часов.

Хотя понятие «тепловой шок» продолжает широко использоваться, становится очевидным, что под ним подразумевается широкий спектр реакций микробной клетки, включая реакции на голодание, окислительный стресс, снижение водной активности окружающей среды, нарушения дыхательной цепи, воздействие тяжелых металлов и анаэробных условий, воздействие этанола. Этим объясняется тот факт, что листерии, обработанные сублетальной дозой этанола, становятся устойчивыми, например, к кислотам и солям в дозах, которые для необработанных клеток являются смертельными.

В литературе описаны другие примеры подобных перекрестных реакций. Так, семь штаммов Е. coli 0157:Н7 были подвергнуты тепловому шоку (прогреты при 48 °С, рН — 7, в течение 10 мин) до того, как их поместили в кислую среду (рН — 2,5 при 37 °С). При этом оказалось, что данные клетки были в 10-100 раз более кислотоустойчивыми (в зависимости от штамма), чем контрольные. Еще более выраженная кислотоустойчивость наблюдалась у клеток, подвергнутых предварительному воздействию кислой среды (рН — 5). Отсюда можно заключить, что благодаря таким перекрестным реакциям выживаемость кишечной палочки в пищевых продуктах или пищевых ингредиентах, подвергнутых незначительным тепловым обработкам и используемых, например, в ацидофицированных продуктах (лимонады, майонез, салатные соусы и т. д.), может быть неожиданно высокой. Более того, это может влиять на вирулентность патогенных бактерий, так как кислотоадаптированные клетки будут более легко проникать через защитный кислотный барьер желудка.

 

ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ МИКРОБНОЙ ПОПУЛЯЦИИ НА СТРЕСС

Ответ микробной популяции на стресс может рассматриваться на основе физических, метаболических реакций или реакций на генетическом уровне. Последние протекают значительно медленнее, чем другие. Наиболее характерным примером может быть рост устойчивости популяции конкретного микробного штамма к антибиотикам, например S. typhimurium 104. Этот процесс связан с определенными генетическими изменениями и появлением «мутантов» (с дефектами в метиленовых концах

ДНК, потерявших способность к восстановлению). Уровень подобных мутантов в свежевыделенных полевых штаммах кишечной палочки и сальмонелл чуть выше 1 %. Это противоречит уже сложившемуся мнению, на основе исследований лабораторных штаммов, что мутации в бактериальной популяции редки.

Большое количество мутантов, вероятно, приведет к увеличению скорости мутации и в последующем — к рекомбинации между особями. Это еще раз говорит о важности проблемы антибиотиковой устойчивости микроорганизмов и проникновения вирулентных генов в популяцию прокариотов.

 

RPOS И «ОБЩАЯ СТРЕССОВАЯ РЕАКЦИЯ» МИКРОБНОЙ КЛЕТКИ

Недавно было показано, что Rpos-протеин является главным, основополагающим звеном в цепи большинства ответных реакций грамотрицательных бактерий на различные стрессы. В эту цепь включается РНК-полимераза, которая определяет специфичность активатора. Последний индуцирует те участки гена, которые начинают функционировать только в условиях стресса клетки. Описано около 20 генов, регулирующих RpoS.

RpoS носит определение как «сигма-фактор стационарной фазы развития микробной популяции», так как его основная роль — стимулировать развитие механизмов, которые имеют место при голодании клетки или при ее переходе в стационарную фазу роста. Именно в этой фазе роста клетки имеют повышенную устойчивость ко многим экстремальным факторам внешней среды, включая низкое значение рН, осмотический стресс, теплоту, дегидратацию и воздействие окислителей (Н202).

RpoS нестабилен в процессе экспоненциального роста, разрушается в процессе протеолиза и прекращает разрушаться при переходе клеток в стационарную фазу развития; концентрация его наращивается и он становится активным. При высокой концентрации клеток они передают друг другу сигналы, например, посредством гомосериновых лактонов или других метаболитов. Может быть, они вовлечены в пусковые процессы, активизирующие деятельность Rpos.

Если говорить о безопасности пищевых продуктов, то становится очевидным, что RpoS может быть ключевым компонентом в регуляции экспрессии генов, ответственных за вирулентность микробной клетки. Некоторые из них, например у сальмонелл, становятся наиболее активными в процессе перехода клеток в стационарную фазу роста или активизируются стрессом.

Осморегулирующие гены вовлечены в экспрессию вирулентности у S. typhimurium и Shigella flexneri. У Y. enterocolitica RpoS ген активизирует выработку термоустойчивого токсина в стационарной фазе роста. В условиях голодания и низких температур кишечная палочка в стационарной фазе роста синтезирует поверхностные фибриллы («завитки»), которые принимают участие в процессе адгезии бактерий к клеткам эукариотов. Экспрессия генов «завитков» отсутствует в клетках — мутантах по RpoS. Индукция генов, ответственных за вирулентность, в начале стационарной фазы роста является также характерной для большинства грамположительных бактерий, например у золотистого стафилококка и листерий.

Хотя система RpoS выявлена у представителей семейства кишечных бактерий, полагают, что подобная система существует у других прокариотов. Например, ftsH ген у В. subtilis индуцируется после осмотического и температурного шока. Считают, что этот ген ответственен за последующие изменения в клетке, обеспечивающие ей повышенную устойчивость.

 

ВЗАИМОСВЯЗЬ RPOS И СИГНАЛЬНЫХ ПРОВОДЯЩИХ СИСТЕМ

В 1980-е гг., еще до открытия роли RpoS гена в защите грамотрицательных бактерий от стресса и повышения вирулентности, была предложена концепция регуляции генной экспрессии факторами окружающей среды. Эта концепция основана на существовании умозрительного трансмембранного белка в зоне цитоплазмы и вне клетки. В этих внеклеточных зонах гипотетический протеин «оценивает» состояние окружающей среды и действует как «передатчик», пересылая сигнал «приемнику» внутри клетки. Последний через фосфорилирование или другими путями воздействует на геном клетки, вызывая перекручивание ДНК, повреждение специфичности РНК-полимеразы и т. д. Подобные явления ассоциируют и с RpoS-системой, но еще неясно — являются ли эти две системы независимыми либо они как-то связаны друг с другом или существование сигнальной проводящей системы стоит под большим вопросом, так как нет убедительных данных, подтверждающих ее присутствие.

Вовлечение RpoS в различные ответные реакции микробной клетки на стресс изменило наше представление о специфичности ответа микробной клетки на конкретное стрессовое воздействие, которое представлено общей защитной реакцией.

 

ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Следует отметить, что в последнее десятилетие изменилось наше представление о некоторых аспектах физиологии микроорганизмов, вызывающих порчу пищевых продуктов и пищевые отравления человека. Стало очевидным, что экспрессия генов, ответственных за «общую защитную реакцию», приводящую к увеличению устойчивости бактерий и усиливающую вирулентность у патогенов, зависит от воздействия на клетку различных факторов (сигналов) окружающей среды. К сожалению, некоторыми из наиболее значимых сигналов окружающей среды, вызывающих стрессовые ответные реакции, являются именно те, которые широко используются в технологических процессах переработки пищевого сырья и продуктов.

В связи с этим может возникнуть вопрос: будет ли продолжаться широкое использование пищевых технологических обработок, которые могут привести к появлению микроорганизмов с более выраженными свойствами, приводящими к порче пищевых продуктов и тяжелым, массовым отравлениям людей? Существует мнение, что тенденция применять «щадящие» технологии для предотвращения порчи пищевых продуктов и профилактики пищевых отравлений позволяет все большему количеству микроорганизмов выживать. Это, в свою очередь, требует все более надежных режимов для угнетения оставшихся в живых клеток. В то же время считают, что слишком «щадящие» технологические обработки не вызовут сильных стрессовых реакций микроорганизмов и в этом случае их устойчивость и вирулентность будет, наоборот, уменьшаться.

Тем не менее можно предположить, что большая выживаемость микроорганизмов в продуктах, прошедших «щадящие» обработки, дает большие возможности для активации процесса обмена генами. Вероятно, что в долгосрочном плане мутации, которые имеют место в результате стрессового воздействия на микробную клетку, могут привести к появлению новых штаммов с повышенной устойчивостью к антимикробным агентам и более выраженной вирулентностью.

Клетки могут давать мутации «напрямую», когда подвергаются голоданию или стрессу (например, это установлено у кишечной палочки). Подобные ускоренные генетические изменения в микробной популяции, подвергнутой стрессу, уже признаны в медицинской и ветеринарной практике, когда идет речь о появлении антибиотиковой устойчивости бактерий. Механизмы этих процессов раскрыты не полностью, но могут начинаться с дифференциации скорости внутренней мутации различных сайтов генома и с большим количеством мутантов в популяции новых «поколений» кишечных бактерий.

С определенностью можно сказать, что «щадящие» обработки, такие как длительное воздействие сублетальных температур или слабого подкисления окружающей микроорганизмы среды, являются важными пусковыми факторами для «общей защитной реакции» микробных клеток, находящихся в пищевых продуктах. Последствием этого может быть резкое увеличение выживаемости клеток, когда указанные воздействия, но уже в жестких режимах, будут широкомасштабно применяться на практике в процессе производства пищевых продуктов.

Стрессовые ответные реакции микроорганизмов следует также учитывать при определении микробной выживаемости и при оценке риска возможной микробной контаминации пищевых продуктов. Последнее необходимо для установления микробиологических показателей, которые могут использоваться для контроля их качества и безопасности контроля, в том числе в рамках концепции «критических контрольных точек пищевого производства», которая будет изложена позже. При этом следует признать, что стресс приводит к формированию живых некультивируемых форм бактерий, которые, как правило, не выделяются при использовании обычных микробиологических методов и требуют специальных подходов для индикации (например, генные пробы для обнаружения микробных клеток в состоянии стресса).

Для того чтобы избежать «общей защитной реакции» микробных клеток на стресс, следует использовать такие воздействия и технологические процессы, которые уничтожат патогенные микроорганизмы в пищевых продуктах. Хотя в настоящее время наиболее широко для этих целей применяется высокая температура, имеется ряд новых технологических приемов, которые достигают подобной цели и не влияют на органолептику продукта (высокое гидростатическое давление, пульсирующие электро-поля). Целесообразно и в дальнейшем развивать новые подобные подходы.

 

Контрольные вопросы и задания

  • Почему сырье животного и растительного происхождения является благоприятной средой для развития микроорганизмов, в том числе для возбудителей порчи, патогенных и условно-патогенных бактерий?
  • Охарактеризуйте влияние состава пищевого продукта на микроорганизмы.
  • Охарактеризуйте влияние различных температур на микроорганизмы и изменение их биологических свойств.
  • Дайте характеристику влияния на микробные клетки такого показателя, как активность воды.
  • Охарактеризуйте влияние рН среды на микроорганизмы и изменение их биологических свойств.
  • Опишите основные ответные реакции микробной клетки на стресс.
  • Дайте определение терминам «RpoS» и «общая стрессовая реакция» микробной клетки. Охарактеризуйте взаимосвязь RpoS и сигнальных проводящих систем.