Задачи микробиологического контроля на предприятиях пищевой отрасли: быстрое обнаружение микробных контаминантов и выявле­ние путей их проникновения в производство; определение очагов и степени размножения микроорганизмов на отдельных этапах техно­логического процесса; предотвращение развития посторонней мик­рофлоры путем использования различных профилактических меро­приятий; активное уничтожение микроорганизмов путем дезинфек­ции с целью получения высококачественной готовой продукции.

Микробиологический контроль должен проводиться заводскими лабораториями систематически. Он осуществляется на всех этапах технологического процесса, начиная с сырья и заканчивая готовым продуктом на основании государственных стандартов (ГОСТ), технических условий (ТУ), инструкций (ТИ), правил, методических указа­ний и другой нормативной документации, разработанной для каждой отрасли пищевой промышленности. Для отдельных пищевых про­изводств имеются свои схемы микробиологического контроля, в ко­торых определены объекты контроля, точки отбора проб, периодич­ность контроля, указывается, какой микробиологический показатель необходимо определить, приводятся нормы допустимой общей бакте­риальной обсемененности.

Микробиологический мониторинг на предприятии обычно вклю­чает следующие шаги.

1. Выделение микроорганизмов из производственной среды.
2. Посев (если требуется).
3. Учет результатов.
4. Анализ совокупности полученных при мониторинге данных.

Микробиологический контроль включает оценку микробной контаминации воды, воздуха производственных помещений, пищевых продуктов, санитарного состояния технологического оборудования, инвентаря, тары, гигиенического состояния обслуживающего пер­сонала (рук, одежды и т. п.). Он осуществляется как микробиологиче­ской лабораторией предприятия, так и санитарно-эпидемиологиче­скими станциями.

Возможное загрязнение внешней среды патогенными микробами определяют на основании косвенного показателя – обнаружения так называемых санитарно-показательных микроорганизмов: кишечной палочки, гемолитических стрептококков и стафилококков. Присут­ствие этих микроорганизмов в объектах внешней среды указывает на загрязненность их выделениями человека, животных, сточными во­дами биотехнологических производств и т. п.

В тех пищевых производствах, где применяются ферментные пре­параты, также обязателен микробиологический контроль их актив­ности и биологической чистоты.

Санитарно-показательные микроорганизмы

Сведения о возможности опасного в эпидемическом отношении загрязнения окружающей среды дает количественный учет сани­тарно-показательных микроорганизмов. Это связано с тем, что не­посредственное обнаружение патогенных микроорганизмов в естест­венных субстратах (почве, воде, воздухе) наталкивается на следующие трудности:

• патогенные микроорганизмы встречаются в объектах окружаю­щей среды не постоянно, а главным образом в период эпидеми­ческих вспышек;
• количество патогенных микроорганизмов во внешней среде значительно уступает количеству непатогенных;
• применение элективных сред и методов культивирования пато­генных микроорганизмов не всегда гарантирует успех.

Поэтому возможное загрязнение внешней среды патогенными микроорганизмами определяют на основании косвенного показате­ля – обнаружения так называемых индикаторных микроорганизмов. Присутствие санитарно-показательных микроорганизмов в объектах внешней среды указывает на загрязненность их выделениями чело­веческого организма, а следовательно, и возможность наличия в них соответствующих патогенных микроорганизмов. Чем больше коли­чество санитарно-показательных микроорганизмов в исследуемом объекте, тем больше он загрязнен выделениями человеческого орга­низма и тем вероятнее, что в нем содержатся патогенные микроорга­низмы – возбудители инфекционных заболеваний.

Индикаторная ценность микроорганизма определяется по ряду критериев:

• индикаторный микроорганизм должен иметь общее место ес­тественного обитания с соответствующим патогенным микро­организмом и аналогичный способ распространения в окружа­ющей среде;
• санитарно-показателъные микроорганизмы должны несколько превосходить патогенные микроорганизмы по выживаемости в окружающей среде, по устойчивости к воздействию различных физических, химических и биологических факторов;
• одними из условий при выборе санитарно-показательного мик­роорганизма являются простота, доступность методов его опре­деления, быстрота в получении ответа.

Многолетние исследования, подтвержденные практикой во мно­гих странах мира, позволили отдать предпочтение бактериям группы кишечной палочки (БГКП) (рис. 16) как основному и наиболее на­дежному показателю фекального загрязнения воды, пищевых продук­тов, смывов с оборудования и рук персонала.

 Рис. 16. Кишечная палочка Escherichia coli (фото, х 1250)

Гемолитические стафилококки являются санитарно-показательными микроорганизмами загрязнения воздуха, т. к. они являются постоянными обитателями слизистых оболочек рта и верхних дыха­тельных путей человека. В группу санитарно-показательных спорообразующих анаэробов почвы входят грамположительные споровые па­лочки – Clostridium perfringens и Clostridium sporogenes.

Контроль пищевых продуктов

Для оценки качества сырья, полуфабрикатов, вспомогательных ма­териалов, готовой продукции в нашей стране обязательно используются два показателя – общая микробная обсемененность (общее микробное число – ОМЧ) или количество мезофильных аэробных и факульта­тивно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) и бактерии группы кишечной палочки (БГКП). На практике ОМЧ и КМАФАнМ оценива­ются числом жизнеспособных клеток, способных образовывать коло­нии на поверхности питательной среды, и выражаются количеством колониеобразующих единиц (КОЕ).

Показатели общей бактериальной обсемененности, ОМЧ, КМАФАнМ выражают в КОЕ/г или КОЕ/см³ и определяют в основ­ном путем высева продукта или пробы на стандартную плотную пита­тельную среду методом глубинного посева. После посева чашки ин­кубируют (78 ± 3) ч при температуре (30 ± 1) °С. По окончании срока производят подсчет выросших колоний. Число колоний, выросших на каждой чашке Петри, пересчитывают на 1 г или 1 см³ продукта.

Необходимо заметить, что полученные результаты будут меньше истинной контаминации продукта, так как микроорганизмы обла­дают способностью адсорбироваться на взвешенных веществах с образованием трудноразделимых в процессе взбалтывания комп­лексов, которые при посевах могут регистрироваться как один мик­роорганизм. Чашечным методом учитываются только сапрофит­ные мезофильные бактерии (аэробы и факультативные анаэробы). Термофильные и психрофильные бактерии не растут из-за несоот­ветствия температуры оптимальной; анаэробы не растут, поскольку выращивание проводится в аэробных условиях; другие бактерии (в частности, патогенные) не растут из-за несоответствия компо­нентного состава питательной среды и условий культивирования. Не образуют колоний мертвые клетки. Однако эти микроорганизмы можно не учитывать и ошибкой анализа пренебречь, поскольку сап­рофиты являются основными возбудителями порчи пищевых про­дуктов. Для этого в микробиологических исследованиях введено по­нятие доверительного интервала.

В некоторых производствах используются дополнительные микро­биологические показатели, например, количество анаэробных, термо­фильных, спорообразующих и других микроорганизмов, характерных для каждого вида исследуемого объекта. Для их учета имеются специ­альные методические приемы, описанные в соответствующей норма­тивной документации. Например, для определения процентного со­держания спорообразующих бактерий посев производят из пробирок с разведениями проб, предварительно прогретых несколько минут на кипящей водяной бане. При высевах из прогретых проб вырастают только спорообразующие бактерии, а из непрогретых – все осталь­ные. Затем рассчитывают процентное содержание спорообразующих форм микроорганизмов.

Чем выше показатель общей бактериальной обсемененности, тем больше вероятность попадания в исследуемый объект патогенных микроорганизмов – возбудителей инфекционных болезней и пище­вых отравлений. Обычно в 1 г (или 1 см³) продукта, не прошедшего термической обработки, содержится не более 100 тысяч сапрофитных мезофильных бактерий.

Определение БГКП (колиформных бактерий) основано на спо­собности колиформных бактерий расти на дифференциально-диа­гностических средах, сбраживая лактозу с образованием кислоты и газа.

Санитарно-микробиологическое исследование воды

Вода является благоприятной средой для развития различных мик­роорганизмов, в том числе и возбудителей многих инфекционных за­болеваний. В связи с этим санитарно-микробиологический анализ водоемов и питьевой воды является обязательным и важнейшим эта­пом системы контроля качества воды. Качество питьевой воды, по­даваемой централизованными водопроводами для питьевых и хо­зяйственно-бытовых целей, должно соответствовать гигиеническим нормам (см. СанПиН 2.1.4.1074-01).

Сведения о возможности опасного загрязнения окружающей среды дает количественный учет санитарно-показательных микроорганиз­мов. Обнаружение данных микроорганизмов в воде следует рассмат­ривать как показатель фекального загрязнения, а их количество поз­воляет судить о степени этого загрязнения, а значит, о возможности присутствия патогенной микрофлоры.

Преимущество БГКП как показателя фекального загрязнения со­стоит в полном соответствии основным требованиям, предъявляемым к санитарно-показательным микроорганизмам.

К БГКП относятся грамотрицательные, не образующие спор па­лочки, ферментирующие лактозу, глюкозу, маннит, мальтозу при 37 °С в течение 24 ч и не обладающие оксидазной активностью. Таким об­разом, кишечная палочка, представитель нормальной микрофлоры кишечника человека, является показателем фекального загрязнения объектов внешней среды.

Чаще всего при санитарно-микробиологическом исследовании воды на производствах проводят следующие определения:

1. микробного числа – общее количество микроорганизмов в 1 см³ воды;
2. микробного числа – общее количество микроорганизмов в 100 см³ воды при 37ºС;
3. микробного числа – общее количество микроорганизмов в 100 см³ воды при 22ºС;
4. количества общих и термотолерантных колиформных бактерий в 100 см³;
5. спор сульфитредуцирующих клостридий.

Безопасность питьевой воды в эпидемическом отношении опреде­ляется ее соответствием нормативам по микробиологическим и паразитологическим показателям, представленным в табл. 4.

Таблица 4

Микробиологические и паразитологические показатели безопасности питьевой воды

Внутренний контроль качества санитарно-микробиологических исследований воды проводят в соответствии с МУ 2.1.4.1057-01.

Отбор проб производят в соответствии с МУК 4.2.1018-01. Воду для санитарно-микробиологического исследования отбирают в сте­рильные емкости.

Из кранов водопроводных сетей отбор проб воды производят после предварительного фламбирования кранов и спуска воды в те­чение 10 мин при полном открытии крана.

Определение общего микробного числа воды. Общее микробное за­грязнение определяется количеством микроорганизмов, содержа­щихся в 1 см³ воды, глубинным посевом на питательный агар. В водо­проводной (или питьевой) воде в соответствии с СанПиН 2.1.4.1074-01 микробное число не должно превышать 50 КОЕ в 1 см³. В соответ­ствии с требованиями ВОЗ (Всемирной организации здравоохране­ния) ОМЧ также определяют, инкубируя посевы при 37 и 22ºС.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий ме­тодом мембранной фильтрации (основной метод). Общие колиформные бактерии (ОКБ) – грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (37 ± 1) °С в течение 24-48 ч.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (44 ± 0,5) °С за 24 ч.

Определение ОКБ и ТКБ методом мембранной фильтрации пред­полагает фильтрацию установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивание посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификацией колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 см³. При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 см³ воды через один фильтр.

При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличение количества фильтруемых объемов для получения изо­лированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 см³ воды).

Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры. По окончании фильтрации фильтр аккуратно снимают стерильным пинцетом и помещают в центр чашки Петри на поверхность среды Эндо фильтрующей поверхностью вверх. При этом следует избегать образования пузырьков воздуха между средой и фильтром. Чашки с фильтрами ставят в термостат и инкубируют посевы при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 2) ч (рис. 17). Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, про­зрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 см³ исследуемой воды.

Рис. 17. Схема определения общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха

Микробиота воздуха весьма немногочисленна и не отличается раз­нообразием. Ее количественный и качественный состав зависит от места, над которым исследуется воздух. Воздух является неблагопри­ятной средой для развития и жизнедеятельности микроорганизмов, т. к. в нем нет питательных веществ и пагубно влияет УФ-излучение.

Задачей микробиологического контроля является получение репрезентативной оценки микробной нагрузки производственной среды.

Текущий контроль бактериальной загрязненности воздуха в прин­ципе не может и не должен выявить или подсчитать все микро­организмы, присутствующие в контролируемой среде. Он может только показать, что все ключевые системы, контролирующие со­стояние производственной среды, работают в соответствии с уста­новленными требованиями и лимиты бактериальной нагрузки не превышены. В пробе воздушных масс учитывают общее число мик­роорганизмов, содержащихся в определенном объеме воздуха, и ка­чественный состав микрофлоры воздуха.

В воздухе закрытых помещений содержится большое количество различных форм микроорганизмов: пигментированные бактерии, микрококки, спорообразующие палочки, дрожжи, мицелиальные грибы. Санитарно-показательными микроорганизмами воздуха явля­ются гемолитические стафилококки, т. к. эти микроорганизмы – по­стоянные обитатели слизистых оболочек полости рта, верхних дыха­тельных путей человека.

Для оценки санитарно-гигиенического состояния воздуха поме­щений определяют общее количество микробов, находящихся в 1 м³ воздуха и количество санитарно-показательных микроорганизмов в том же объеме воздуха.

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха прово­дится несколькими методами: седиментационным, аспирационным, барботированием стерильной воды или физиологического раствора с последующим высевом пробы на питательную среду методом мемб­ранной фильтрации или пропусканием воздуха непосредственно че­рез питательную среду.

Седиментационный метод (метод Коха) – оседание микроорга­низмов под воздействием силы тяжести на поверхность питательной среды чашки Петри. Количество выросших колоний соответствует степени загрязненности воздуха: по приблизительным подсчетам на площадь 100 см² (площадь чашки Петри) в течение 5 мин попа­дает столько микробов, сколько их содержится в 10 дм³ воздуха. Опи­санный метод относится к пассивным (качественным), он позволяет лишь определить спектр присутствующих микроорганизмов. Главным его недостатком является выявление только больших быстрооседающих частиц в объеме отобранной пробы.

Аспирационный метод связан с применением аппарата, кото­рый дает возможность исследовать определенный объем воздуха. Работа его основана на принципе ударного действия струи воздуха. Аппарат состоит из узла для отбора проб воздуха, микроманометра и электромотора. Засасываемый воздух распределяется по поверх­ности среды чашки Петри, помещенной во вращающемся устрой­стве. Скорость просасывания воздуха должна быть около 25 дм³/мин. Экспозиция в течение 4–5 мин (т. е. пропускание 100 дм³ воздуха) позволяет выявить общее количество микроорганизмов. Затем чаш­ки Петри закрывают, инкубируют в течение 24 ч в термостате при 37°С и 24 ч при комнатной температуре и подсчитывают число вы­росших колоний.

Бактериальную загрязненность воздуха оценивают по количеству микроорганизмов в 1 м³ воздуха, используя готовые производствен­ные таблицы, или рассчитывают по формуле Омелянского:

Х=(А • 100 • 1000 • 5)/(В • 10 • Т),

где X – количество микроорганизмов в 1 м³ воздуха; А – количе­ство колоний в чашке; В – площадь чашки, см²; Т – время, в течение которого чашка была открыта, мин; 5 – время по расчету Омелянс­кого, мин; 10 – объем воздуха, из которого происходит оседание мик­робов за 5 мин, дм³; 100 – площадь, на которую происходит оседание, см²; 1000 – искомый объем воздуха, дм³.

В. Л. Омелянский установил, что за 5 мин при спокойном со­стоянии воздуха на площадь 100 см² оседает столько микроорга­низмов, сколько их содержится в 10 дм³ (это описано выше как ме­тод Коха).

Для выявления санитарно-показательной микрофлоры ранее ис­пользовали кровяной агар, на котором данные микроорганизмы рас­тут желтыми с ровными краями колониями и вызывают гемолиз клеток крови, в результате чего среда вокруг колонии становится про­зрачной, или проводили посев на чашки Петри с желточно-солевым агаром (элективность среды обусловливается содержанием высокой концентрации хлорида натрия). При этом большая часть патогенных стафилококков, образующих летициназу, дает реакцию, проявляющу­юся в образовании вокруг колонии зоны просветления с радужным венчиком по периферии.

В настоящее время для определения количества Staphylococcus aureus применяют агар Байрд-Паркера, а образование термостабиль­ной нуклеазы устанавливают при необходимости определения его по­тенциальной энтеротоксигенности.

Микробная обсемененность различных помещений неодинакова. Критерии чистоты воздуха жилых помещений приведены в табл. 5.

К воздуху производственных цехов пищевых производств предъяв­ляются более строгие требования.

Таблица. 5

Критерий для оценки воздуха жилых помещений
(число микроорганизмов в 1 м³ воздуха по А. И. Шарифу)

Воздух производственных цехов пищевых производств считается чистым, если в нем содержится не более 500 сапрофитных микро­организмов в 1 м³. Вторым показателем является количество в том же объеме воздуха санитарно-показательных микроорганизмов – гемолитических стафилококков. Обнаружение их в воздухе произ­водственных помещений указывает на санитарное неблагополучие данного объекта и возможность возникновения у персонала инфек­ционных заболеваний, вызываемых микрофлорой дыхательных пу­тей, которая передается через воздух (ангины, гриппа, коклюша, дифтерии, туберкулеза и др.). Такой воздух может стать источником обсеменения пищевых продуктов, а следовательно, представлять по­тенциальную опасность для здоровья людей.

Определение в воздухе санитарно-показательных микроорганиз­мов проводят только по эпидемиологическим показаниям городские центры эпидемиологии и гигиены.

Санитарно-микробиологическое исследование смывов с рук, инструментов и предметов производства

Причиной присутствия посторонних микроорганизмов могут быть недостаточная чистота на производстве и несоблюдение людьми правил личной гигиены. С одеждой и обувью работающего персонала в цеха часто заносятся зерновая пыль, грязь, посторон­ние микроорганизмы. Этот источник трудно контролировать. Здесь главным в борьбе с микроорганизмами – контаминантами произ­водства является строгое соблюдение чистоты и личной гигиены рабочими.

Правилами личной гигиены предусмотрен ряд требований к со­держанию тела, рук, полости рта, спецодежды, медицинскому осви­детельствованию.

На поверхности кожи здорового человека находится большое число микроскопических грибов, бактерий – стафилококков, стреп­тококков. При травмах патогенные микроорганизмы проникают в глубокие слои кожи и вызывают гнойничковые заболевания. Особую опасность они представляют на руках и открытых частях тела в связи с угрозой попадания в пищевые продукты стафилококков, стрепто­кокков. На различных участках тела встречаются разные группы мик­роорганизмов, например:

• на коже – Corynebacterium, Staphylococcus, Bacillus;
• в носу – Micrococcus, Corynebacterium, Staphylococcus;
• .в подмышечных впадинах – Micrococcus, Corynebacterium, Sarcina;
• во рту (на деснах) – Corynebacterium, Streptococcus.

Для предотвращения контаминации посторонними микроорга­низмами сырья и полуфабрикатов в процессе их переработки и гото­вой продукции при хранении необходимым условием также являются поддержание чистоты на рабочем месте, в производственных поме­щениях, санитарная обработка оборудования, полов, инвентаря, дре­нажей, тары.

Изучение бактериальной загрязненности рук и предметов окружа­ющей обстановки, инструментов, оборудования производят в целях:

• оценки бактериальной контаминации производственного по­мещения, поверхностей и воздушных масс;
• установления путей распространения инфекции при эпидемио­логических обследованиях;
• контроля эффективности обработки рук и одежды персонала;
  • проверки эффективности мойки и дезинфекции оборудова­ния.

В зависимости от цели проводимого исследования и характера контролируемых объектов в полученных смывах определяют:

• общую микробную обсемененность – ее оценивают посевом в питательный агар (СПА; Стандарт-1-Агар, Plaunt Count Agar и др.). При необходимости определяют количество микробов в 10, 100 см³ смыва и с площади исследуемой поверхности 24– 30 см², возможно при необходимости снятие отпечатков паль­цев на агаре;
• наличие термотолерантных колиформных бактерий как пока­зателей фекального загрязнения, свидетельствующих о грубых нарушениях санитарного режима. Для обнаружения бакте­рий группы кишечной палочки делают посев на селективные питательные среды (Endo, MacConkey, но допускают и дру­гие сходные с ними среды). В смывах с рук персонала цехов не должны присутствовать бактерии группы кишечной па­лочки.

Бактериальную контаминацию рук и одежды определяют путем исследования микрофлоры смывов. В смывах, которые берут перед началом работы, обычно определяют общую бактериальную обсемененность и наличие бактерий группы кишечной палочки. Наличие бактерий группы кишечной палочки в смывах с рук и одежды не до­пускается.

Чистоту рук оценивают по количеству микроорганизмов в 1 см³ смыва:

• отлично – до 1000;
• хорошо –1000-5000;
• удовлетворительно – 5000–10 000;
• плохо – свыше 10 000.

При контроле мелких предметов смывы проводят с поверхности всего предмета. При контроле предметов с большой поверхностью смывы проводят с площади не менее 100 см². Смывы с поверхности предметов делают с помощью трафаретов из проволоки, имеющих площадь 25, 50 или 100 см². Трафареты перед взятием смыва стерили­зуют путем прокаливания в пламени горелки, затем быстро охлаждают и накладывают на поверхность стола и т. д., и с площади, ограничен­ной трафаретом, производят смыв. Затем ватный тампон помещают в пробирку со стерильной водой или физраствором, встряхивают и про­сматривают в микроскоп или делают посев на селективные питатель­ные среды. Посевы должны проводиться не позже 4 ч с момента их от­бора. До анализа смывы должны храниться при температуре не выше 4-5 ºС.