Внешние отличительные признаки большинства микроорганизмов изучают с помощью микроскопа при различных увеличениях.
Современные оитические микроскопы дают увеличение до 2000 раз.
Микроскоп (рис. 9) имеет механическую и оптическую части. Механическая часть состоит из штатива, тубуса, револьверной насадки, предметного столика, макро– и микрометрических винтов.
Рис. 9. Микроскоп биологический МБИ–1:
1 — штатив; 2 — тубус; 3 — револьверная насадка; 4 — предметный столик;
5 — клемма; 6 — макрометрический винт; 7 — микрометрический винт;
8 — окуляр; 9 — объективы; 10 — зеркало; 11 — конденсор
К оптической части относятся объективы, окуляры, зеркало, осветительное устройство (конденсор).
К верхней части штатива крепятся тубус и предметный столик. В тубус сверху вставляется окуляр (окуляры могут быть сменными), а внизу тубуса крепится револьверная насадка, в гнезда которой ввинчиваются 3–4 объектива. Вращая револьверную насадку, можно установить любой объектив в рабочее положение, т. е. под отверстие тубуса. Тубус передвигается с помощью макро– и микрометрического винтов. Макрометрический винт служит для грубой, а микрометрический — для более точной настройки микроскопа.
Отчетливое изображение получается тогда, когда исследуемый предмет попадает в фокус объектива.
Предметный столик может быть квадратным или круглым, подвижным или неподвижным. В центре его имеется отверстие, над которым размещается препарат; препарат фиксируется на столике двумя зажимами (клеммами).
Оптическая часть микроскопа является наиболее важной. Под предметным столиком находится зеркало и конденсор. Зеркало микроскопа с одной стороны вогнутое, с другой — плоское. В зависимости от источника света и характера объекта пользуются той или иной его стороной. Зеркало служит для отражения и направления световых лучей через конденсор в объектив.
Конденсор состоит из нескольких линз, которые фокусируют отраженные от зеркала лучи в плоскости исследуемого препарата. На нижней поверхности конденсора укрепляется ирисовая диафрагма, с помощью которой можно уменьшать или усиливать освещение изучаемого предмета.
Важнейшей частью микроскопа являются объективы. Каждый объектив состоит из нескольких линз, заключенных в общую металлическую оправу, на которой цифрой указывается увеличение. Объективы делятся на сухие и иммерсионные.
При пользовании сухими объективами (Х8, Х20, Х40) между объективом и рассматриваемым предметом находится воздух. При пользовании иммерсионным объективом (Х90, X100) рассматриваемый предмет покрывается каплей специального масла, в которую погружается фронтальная линза объектива, вследствие чего такие объективы называют погружными, или масляными.
Иммерсионные объективы обладают некоторыми преимуществами перед сухими. При рассмотрении препаратов с помощью сухих систем световые лучи проходят через неоднородные среды, которые различаются по показателю преломления: световые лучи из воздуха (показатель преломления 1,0), попадая в предметное стекло (показатель преломления 1,52), а затем опять в воздух, преломляются на границе разнородных сред, отклоняются в сторону, и часть их не попадает в объектив. Поэтому при пользовании сильными сухими объективами освещение изучаемого предмета оказывается ослабленным. При пользовании иммерсионным объективом световые лучи проходят через оптически однородную среду, так как показатель преломления кедрового масла близок к 1,50. Иммерсионные объективы имеют увеличение Х90, Х100 и обозначаются буквами «ОИ» (объектив иммерсионный).
Окуляр состоит из двух линз и дает небольшое увеличение того изображения, которое получается в объективе. Существуют окуляры со следующими увеличениями: Х7, Х10, X15, Х20.
Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Качество микроскопа определяется не только степенью увеличения объекта, но и так называемой разрешающей способностью, т. е. наименьшим расстоянием между двумя точками, изображения которых видны отчетливо под микроскопом. Чем это расстояние меньше, тем разрешающая способность данного микроскопа выше.
Изображение объекта в микроскопе получается обратным, мнимым, увеличенным.
Существуют более совершенные системы микроскопов, позволяющие получить увеличение во много тысяч раз (электронный микроскоп) и дающие высококонтрастные изображения.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ И МИКРОСКОПИРОВАНИЕ ПРОСТЕЙШИХ ПРЕПАРАТОВ
Препараты, рассматриваемые с помощью микроскопа, бывают окрашенными, в которых устанавливают форму, размеры клеток, наличие спор, капсул, способы размножения, и неокрашенными, которых устанавливают подвижность, спорообразование и другие дополнительные признаки рассматриваемого объекта.
В неокрашенном виде микробы исследуются с помощью препаратов «раздавленная капля» и «висячая капля».
«Раздавленную каплю» готовят следующим образом. На середину предметного стекла наносят каплю исследуемого материала (взвеси микробов в физиологическом растворе, бульонной культуры), накрывают сверху покровным стеклом и исследуют с помощью сухих объективов при слегка опущенном конденсоре или суженной диафрагме. Под микроскопом на умеренно светлом фоне обнаруживают живые микробы, которые появляются в разных плоскостях.
Для приготовления «висячей капли» (рис. 10) используют предметное стекло с углублением луночкой и покровное стекло. На середину покровного стекла наносят маленькую каплю исследуемой взвеси микробов, край луночки предметного стекла слегка смазывают вазелином и покровное стекло быстро, но осторожно переворачивают над центром луночки, так чтобы капля свободно висела в углублении, не соприкасаясь с ее дном и краями. Получается закрытая герметичная камера, в которой капля долго не высыхает. При малом увеличении находят края капли, передвигают каплю в центр поля зрения, устанавливают большее увеличение и с помощью микрометрического винта добиваются отчетливого изображения. Микроскопическая картина такая же, как и в «раздавленной капле», но в таком препарате удобно наблюдать рост, деление, размножение микроорганизмов.
Рис. 10. Препарат «висячая капля»:
1 — вид сверху; 2 — вид сбоку
Исследование микробов в окрашенном виде дает возможность при правильном приготовлении препаратов получать четкие, контрастные изображения объектов наблюдения.
Для окраски микробов применяют анилиновые краски, преимущественно основные, реже кислые. Все эти краски имеют вид порошков или кристалликов, из которых готовят спиртовые, спирто–водные и водные растворы красок.
Спиртовые, или насыщенные, растворы красок готовят путем растворения в спирте 10–15% сухой краски (10–15 г краски на 100 мл 96%–ного спирта). Раствор краски оставляют на несколько дней и за это время несколько раз встряхивают. Жидкую часть краски сливают и сохраняют впрок. По мере надобности используют для приготовления спирто–водных растворов.
Спирто–водные растворы готовят путем разведения спиртовых растворов в 3–10 раз дистиллированной водой.
В некоторых случаях с целью усиления красящей способности к растворам красок добавляют щелочи, фенол, таннин и др.
Наиболее употребительными растворами красок являются следующие.
Карболовый фуксин: 1 г основного фуксина растирают в ступке с 5 г карболовой кислоты, добавляя порциями 10 мл этилового спирта и 100 мл дистиллированной воды. Раствору дают постоять двое суток и фильтруют через фильтровальную бумагу.
Разведенный карболовый фуксин готовят из карболового фуксина путем разведения его 1 : 10 дистиллированной водой.
Карболовый генцианвиолет приготовляют аналогично карболовому фуксину.
Водные растворы метиленовой сини, кристаллвиолета, метилвиолета готовят путем растворения 1 г краски в 300 мл дистиллированной воды.
После приготовления краски профильтровывают через фильтровальную бумагу и хранят в темном месте. Для работы краски разливают во флаконы с пипетками или в капельницы с притертыми пробками.
Приготовление окрашенного препарата состоит из приготовления мазка, высушивания, фиксации и окраски.
Мазки готовят на чистых обезжиренных предметных стёклах, стремясь равномерно распределить материал (взвесь микробов, бульонную культуру и т. п.). Материалы берут стерильной, охлажденной бактериологической петлей, пипеткой или захватывают стеклянной палочкой и размазывают на середине обезжиренного предметного стекла в виде пятна площадью 2–4 см2. Если материал густой (агаровая культура), то он эмульгируется в капле воды или физиологического раствора, предварительно нанесенной на предметное стекло.
Приготовленный мазок выдерживают до полного высыхания. Не следует при этом препарат нагревать, так как это ухудшает его качество.
Сухой препарат подвергается фиксации. Наиболее часто применяется фиксация жаром путем быстрого троекратного проведения предметного стекла мазком кверху над пламенем горелки. При фиксации микробы погибают и в связи с этим лучше воспринимают окраску. Фиксация обеспечивает безопасность при дальнейшей работе (в случае исследования болезнетворных микроорганизмов) и закрепляет клетки высохшей поверхностной слизью на предметном стекле, позволяя не потерять их при последующей обработке струей воды. Нельзя фиксировать невысохшие мазки.
После фиксации мазок окрашивают. Несколько капель краски наливают на мазок. По истечении необходимого срока окрашивания краску сливают, препарат промывают водой и высушивают на воздухе или с помощью фильтровальной бумаги, которую осторожно прикладывают к предметному стеклу. Окрашенный мазок должен быть абсолютно сухим. Микроскопирование окрашенного препарата производится под иммерсионным объективом в капле кедрового масла.