В процессе физиологической жизнедеятельности микроорганизмов-прокариот осуществляется непрерывный обмен ве­ществ микробной клетки с естественной или искусственной средой обитания (окружающая среда, организм человека и животных, питательные среды). Основные физиологические функции клетки заключаются в питании, дыхании, росте и размножении. Совокупность взаимосвязанных реакций синте­за и распада веществ – анаболизма (конструктивного обмена) и катаболизма (энергетического обмена) составляют основу метаболизма микроорганизмов. В процессе метаболизма про­исходят также реакции промежуточного обмена – амфиболизма. Конечные продукты, образующиеся в ходе метаболизма, называются метаболитами, а промежуточные – амфиболитами.

В ходе анаболизма происходит синтез сложных макромоле­кул из более простых, а также образование или обновление клеточных структур. При катаболизме, наоборот, сложные вы­сокомолекулярные органические соединения расщепляются на составляющие низкомолекулярные вещества. Все реакции кон­структивного обмена относятся к восстановительным и сопряже­ны с использованием химической энергии, аккумулированной в фосфатных связях и других богатых энергией соединениях. Реакции энергетического обмена – окислительные и сопровож­даются выделением энергии. Источниками энергии могут быть органические и неорганические субстраты, свет.

Метаболические реакции условно делятся на первичные и вторичные. Первичные метаболические реакции способствуют образованию и расщеплению белков, их предшественников, оснований, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и т.д. Вторичные метаболические реакции связаны с образованием ве­ществ, несущественных для функционирования микробной клетки. Соответственно, метаболиты подразделяют на первич­ные (ферменты, антигены, другие белки) и вторичные (анти­биотики, бактериоцины, токсины, гормоны и т.д.). Образую­щиеся метаболиты могут иметь эндогенную локализацию (эндометаболиты) или выделяться экзогенно (экзометаболиты).

Реакции первичного обмена связаны с периодом активного роста и размножения микробных клеток, а реакции вторичного обмена – с замедлением скорости размножения клеток или с их деструкцией.

9.1.1. Питание микроорганизмов

Микроорганизмы характеризуются разной способностью использовать органические и неорганические источники пита­ния и энергии. Чем больше готовых соединений получает микроорганизм, тем ниже его способность к биосинтезу ос­новных клеточных макромолекул. Для питания прокариотической клетки используются углерод, азот, кислород, водород, фосфор- и серосодержащие вещества, а также потребляются ионы К, Са, Na, Mg, Fe, другие элементы и микроэлементы (Мо, Zn, Cu, Co, Ni и т.д.). Наиболее важными из этих веществ являются углерод и азот, входящие в состав многих органичес­ких биополимеров клетки. По характеру усвоения углерода и азота определяют типы питания микроорганизмов.

По способности усваивать углерод бактерии подразделяют на две группы: аутотрофов (от греческого autos – сам, trophe – питание), потребляющих в качестве единственного источника СО₂ (например, почвенные бактерии), и гетеротрофов (от греч. heteros – другой), усваивающих углерод органических соедине­ний (гексозы, иногда – пентозы, многоатомные спирты, орга­нические кислоты, аминокислоты и т.д.). Некоторые представители прокариот потребляют восстановленные углеродные со­единения. Например, углеводороды могут утилизировать Соrynebacterium, Pseudomonas, Mycobacterium.

По способности усваивать азот, необходимый для синтеза аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, мик­роорганизмы делят на аминоаутотрофов, использующих для синтеза белка молекулярный азот воздуха (например, азотобак­тер, клубеньковые бактерии, актиномицеты, цианобактерии), и аминогетеротрофов, использующих азот органических соеди­нений (белки, аминокислоты, мочевина и др.), расщепляя их с выделением аммиака. Большинство бактерий потребляют азот в восстановленной форме (соли аммония – NH₄⁺ и аммиака – NH₃), например некоторые энтеробактерии, Staphylo­coccus saprophytics и др. Ряд бактерий усваивают азот аммо­нийных солей (нитратов и нитритов) в присутствии аминокис­лот и пуринов (Proteus, Salmonella, Shigella, Vibrio и др.). Асси­миляции азота аминогетеротрофами могут способствовать фак­торы роста (Yersinia, Corynebacterium, Mycobacterium и др.).

Прихотливые микроорганизмы нуждаются в сложных по своему составу питательных средах (Bartonella, Listeria, Haemo­philus, Francisella и др.).

Органотрофы разделяют на сапрофитов (от греч. sapros – гнилой, phyton – растение) и паразитов (от греч. parasitos – нахлебник). К сапрофитам относится наибольшая часть суще­ствующих бактерии. Паразиты (около 0,1 % видов бактерий) существуют за счет органических веществ живых клеток. Раз­личают облигатных (риккетсии, вирусы и др.) и факультативных паразитов (возбудители менингита, гонореи, сибирской язвы, пневмонии, дизентерии, коклюша, туберкулеза). Однако не всегда между ними, а также сапрофитами, можно сделать чет­кое разделение, так как в зависимости от условий обитания патогенные бактерии могут существовать в природе как сапро­фит и способны вызвать заболевания у человека и животных.

Органические соединения, не синтезируемые многими про­кариотами, но необходимые для их жизнедеятельности и по­лучаемые из среды, называют факторами роста (например, ви­тамины, аминокислоты, пурины, пиримидины и др.). Прихот­ливые бактерии, нуждающиеся в каком-либо из факторов рос­та, относят к ауксотрофам. Ауксотрофность может возникать вследствие мутаций в геноме. Микробы, способные самостоя­тельно синтезировать факторы роста, называют прототрофами. Прототрофов, от которых возникли ауксотрофные варианты, называют культурой "дикого типа". Потребности бактерий в факторах роста существенно различаются. Так, молочнокислые бактерии являются ауксотрофами по многим аминокислотам, пуринам, пиримидинам, витаминам. Штаммы E.coli оказыва­ются ауксотрофными, как правило, по какому-то одному фак­тору роста. Очень часто микробы ауксотрофны по аминокислотам. Для Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae, Bacillus anthracis фактором роста является глутаминовая кислота. Hae­mophilus influenzae требует для выращивания гемин (компонент цитохрома, Х-фактор) и коэнзим (V-фактор) фермента дегидрогеназы. Ауксотрофность в отношении витаминов, особенно группы В, входящих как кофакторы в ферменты, выявлена у многих микроорганизмов. Так, ауксотрофность к витамину В₅ (никотинамид) наблюдается у Shigella, В тиамине (В₁) нужда­ются Brucella, Leuconostoc, в витамине Н (биотин) нуждается Candida, в пантотеновой кислоте – Cl.tetani.

Ростовыми факторами являются также витамин В₂ (рибо­флавин), входящий в дыхательные ферменты – дегидрогеназы, витамин В₆, содержащийся в трансаминазах и декарбоксилазах. Для Streptococcus pneumoniae, N. gonorrhoeae, Shigella ростовым фактором оказалась также парааминобензойная кислота, необ­ходимая для образования аминокислот (серии, гистидин, ти­розин, метионин) и пуриновых оснований. Многие бактерии нуждаются в фолиевой кислоте (Enterococcus faecalis и др.). Осо­бенностью микоплазм является ауксотрофность к веществам, необходимым для биосинтеза мембранных структур (стерины, жирные кислоты с длинной углеродной цепью, глицерин).

Ростовые факторы требуются бактериям в очень низких концентрациях. Для оптимального роста ауксотрофных бакте­рий достаточно 20–50 мкг/мл аминокислот, 10–20 мкг/мл пуринов и пиримидинов, от 0,2 до 50 мкг/мл витаминов. Рос­товые факторы для добавления к питательным средам могут быть получены в виде экстрактов из дрожжей, печени и сердца животных, яиц, семян, проростков зерновых, а также препара­тов крови и др.

По источникам энергии микроорганизмы разделяют на фототрофов, использующих солнечный свет, и хемотрофов, полу­чающих энергию за счет окислительно-восстановительных ре­акций.

По признаку донорства электронов бактерии делят на литотрофов (от греч. litos – камень), способных использовать не­органические соединения в качестве доноров электронов (Н₂, СО₂, NH₃, H₂S, Fe²⁺ и т.д.), и органотрофов, использующих органические вещества. Некоторые микроорганизмы от одного типа питания могут переходить к другому типу.

С учетом использования различных источников получения углерода, азота, энергии и электронов охарактеризованы четы­ре основных типа метаболизма прокариотических микроорга­низмов: фотолитоаутотрофы (используют СO₂, свет, неоргани­ческие соединения), фотоорганотрофы (используют СO₂, свет, органические соединения), хемолитоаутотрофы (используют СO₂, неорганические вещества и их окисление) и хемоорганогетеротрофы (используют органические соединения и их окис­ление).

9.1.2. Транспорт питательных веществ в клетку

Клеточная стенка микроорганизмов хорошо проницаема для экзогенных субстратов, молекулярная масса которых менее 600 Да, и задерживает высокомолекулярные соединения (на­пример, декстраны). Для транспорта питательных веществ че­рез следующий барьер – цитоплазматическую мембрану, помимо диффузии, необходима специальная система переноса. При этом важную роль играет структура клеточной мембраны, включающей липидные и белковые молекулы, которые распо­ложены в определенном порядке. Заряженные группы этих молекул ориентированы концами к поверхности мембраны. От заряда поверхностных коллоидных структур зависит поступле­ние минеральных солей, диссоциирующих на ионы. Противоположно заряженные частицы легче проникают через цито­плазматическую мембрану. Транспорт веществ через клеточ­ную мембрану происходит несколькими способами.

1. Пассивная диффузия. Вещества с низкой молекулярной массой и определенной степенью липофильности проникают через мембрану медленно, без затрат энергии, по градиенту концентрации для неэлектролитов и градиенту электрических потенциалов для ионов (от большей концентрации к меньшей). Таким способом поступают вода, ингибиторы, яды и другие субстанции.
2. Облегченная диффузия. Транспорт веществ извне осущест­вляется от более высокой концентрации к меньшей без затрат энергии, с участием субстрат-специфического мембранного белка со свойствами экзофермента – пермеазы (транслоказы). Синтез пермеаз, локализующихся на цитоплазматической мем­бране, индуцируется субстратом. Пермеаза катализирует при­соединение транспортируемых веществ к своему активному центру и проводит его с наружной поверхности мембраны на внутреннюю. Затем она освобождается от вещества и вновь вступает во взаимодействие с субстратом.
3. Активный транспорт. Перенос осуществляется с затратами метаболической энергии, а также с участием субстрат-специфи­ческих транспортных белков. Поступление веществ может про­исходить против градиента концентрации, т.е. от меньшей кон­центрации к большей. Перенос молекулы питательного суб­страта осуществляется без ее изменения с участием пермеаз.
4. Транслокация химической группы. Транспорт осуществля­ется с затратами энергии. При переносе с помощью фосфо-трансферазной системы молекула трансформируется, напри­мер фосфорилируется. Этот вид транспорта известен для кар-богидратов (глюкозы, фруктозы, зланнитола и родственных им соединений). На транспорт веществ микроорганизм расходует значительное количество вырабатываемой энергии, поскольку на перенос одной молекулы субстрата расходуется одна моле­кула АТФ (аденозинтрифосфат).

Чаще всего выход вещества из микробной клетки осущест­вляется путем пассивной или облегченной диффузии.

9.1.3. Дыхание бактерий. Энергетический метаболизм

Совокупность биохимических процессов, при которых вы­свобождается энергия, обеспечивается жизнедеятельность бак­терий, называется дыханием (биологическое окисление). В про­цессе окисления окисляемый субстрат отдает электроны (до­нор), а восстанавливаемое вещество получает их (акцептор). Высвобождающаяся энергия используется клеткой через АДФ (аденозиндифосфат) и АТФ (аденозинтрифосфат). В бактери­альных клетках эти процессы проходят в мезосомах (аналогах митохондрий у высших организмов). Окислению подвергаются углеводы (в первую очередь глюкоза), спирты, органические кислоты, жиры и т.д. У большей части аэробных бактерий, использующих органические субстраты, аэробное окисление связано с окислением пировиноградной кислоты по циклу трикарбоновых кислот (цикл Кребса). При этом окисление органического субстрата проходит с отщеплением водорода и его переносом на фермент, а также с обеспечением клетки промежуточными продуктами цикла трикарбоновых кислот. Некоторые микробы прлучают энергию из минеральных соеди­нений, например железобактерии получают энергию при окис­лении железа (Fе²⁺ → Fе³⁺). Энергия используется для фик­сации СО₂. Бактерии, утилизирующие серу, обеспечивают клетки энергией при окислении серосодержащих соединений. Наибольшая часть прокариот снабжается энергией путем дегидрогенирования.

По типу дыхания микроорганизмы подразделяют на не­сколько групп.

Облигатные (строгие) анаэробы. Рост и развитие в среде происходят при отсутствии свободного кислорода. Дыхание осу­ществляется посредством анаэробного дегидрирования (фермен­тации субстрата). Кофермент дегидрогеназы – никотинамид-адениндинуклеотид (НАД) отнимает водород от субстрата. При этом образуется НАД∙Н₂, от которого водород передается сле­дующему коферменту дегидрогеназы – флавинаденозиндинук-леотиду (ФАД), превращающемуся в ФАД∙Н₂. Конечными ак­цепторами электронов при "анаэробном дыхании" могут быть сульфаты, нитраты, нитриты, сера, Fе³⁺. Если конечным ак­цептором водорода является органический субстрат (пируват, лактат и др.), этот процесс называют брожением. По выходу конечного продукта различают реакции типов брожения: спир­товое, молочнокислое, маслянокислое, пропионовокислое и т.д.

Анаэробное расщепление одной молекулы глюкозы (броже­ние) осуществляется следующим образом:

С₆Н₁₂О₆ → 2С₂Н₅ОН + 2СO₂ + 31,2 ккал.

Присутствие кислорода в среде губительно для анаэробов, так как конечным продуктом окисления органического суб­страта является перекись водорода. Анаэробы не синтезируют каталазу, разлагающую перекись водорода, и поэтому гибнут.

К облигатным анаэробам относятся клостридии (возбудите­ли столбняка, газовой гангрены, ботулизма и др.).

Облигатные (строгие) аэробы. Рост и развитие происходит в атмосфере кислорода (около 20 %). Облигатные аэробы ис­пользуют дыхание для получения энергии, которую клетка запасает в виде АТФ. Реакции окисления осуществляются пу­тем аэробного дегидрирования с участием молекулярного кис­лорода и образованием значительного количества энергии. Перенос электронов происходит с помощью цитохромов а, b, с, являющихся белковым комплексом молекул с железосодержа­щей химической группой – гемом. Атом железа в геме попере­менно окисляется до Fe³⁺ (отдает электрон) и восстанавливается до Fe²⁺ (присоединяет электрон). Через систему цитохро­мов электрон передается цитохромоксидазе. При этом кисло­род воздуха связывает электрон и водород среды, образуются вода и перекись водорода.

В аэробных условиях окисление глюкозы осуществляется следующим образом:

С₆Н₁₂O₆ + 6O₂ → 6СO₂ + 6Н₂O + 688,5 ккал.

При аэробном расщеплении одной молекулы глюкозы вы­деляется примерно в 22 раза больше энергии, чем при анаэ­робном.

К облигатным аэробам принадлежат туберкулезная палочка, бруцеллы и др. Они растут на поверхности жидких и плотных питательных сред.

Микроаэрофилы. Бактерии требуют для своей жизнедеятель­ности существенно меньшего количества кислорода. Некото­рые из них ("капнофильные микроорганизмы" от греч. kapnos – дым, philos – любящий) хорошо растут при повышенном со­держании СO₂. Высокие концентрации свободного кислорода воздуха задерживают рост микроаэрофилов. К микроаэрофилам относятся лептоспиры, боррелии, актиномицеты и др.

Факультативные анаэробы. Размножение может происходить как при наличии, так и в отсутствие молекулярного кислорода. К факультативным анаэробам относится большинство патоген­ных, условно-патогенных и сапрофитных бактерий (эшерихии, брюшнотифозная, паратифозная, дизентерийная бактерии, стреп­тококки и т.д.). Факультативные анаэробы одновременно могут осуществлять как аэробное окисление, так и брожение (гликолиз), конечным продуктом которого является молочная кисло­та. Например, Escherichia coli в углеводной среде вначале ведет себя как анаэроб, затем растет как анаэроб, окисляя продукты брожения, например молочную кислоту, до СO₂ и воды.

9.1.4. Ферменты микроорганизмов

Ферменты являются высокомолекулярными биологически активными веществами белковой природы, синтезируемыми микробной клеткой. Наименование фермента составляется из названия субстрата с добавлением суффикса "аза" (сахароза – сахараза, лактоза – лактаза и т.д.).

Молекулярная масса ферментов варьирует от нескольких тысяч до сотен тысяч килодальтон. Ферментные белки могут быть простыми, построенными из полипептидных цепей, и сложными (многокомпонентными; как правило, это гликопротеины). Трипсин, пепсин, уреаза, лизоцим, фосфатаза и др. являются простыми белками, а рибонуклеаза, карбоксипепти-даза, амилаза и др. – сложными. Сложные ферментные белки состоят из нескольких частей. Белковый компонент называется апоферментом. Одна из составных частей называется коферментом (если это лабильный диссоциирующий компонент) или простетической группой (если связь с белковым ингредиентом прочная). Коферментами могут быть витамины или комплекс­но соединенные с белком металлы, например Fe в каталазе, пероксидазе, Zn в угольной ангидразе, Ca в щелочной протеазе, Сu в полифенолоксидазе, Мo в нитратредуктазе. Помимо этого, имеются вещества, не входящие в состав фермента, но активизирующие его функции, называемые кофакторами (ве­щества, ионы металлов).

Для ферментов характерна высокая специфичность в отно­шении субстрата. Специфичность обеспечивается активным цент­ром (каталитическим сайтом фермента), построенным из груп­пы аминокислот путем его связи с субстратом в нескольких точках. В активных центрах фермента часто выявляют гистидин, серии, тирозин. В отличие от катализаторов химической природы ферменты катализируют только одну реакцию. Так, лактаза расщепляет только лактозу, сахараза – сахарозу и т.д.

Ферменты объединены в 6 основных классов:

Оксидоредуктазы – участвуют в окислительно-восстанови­тельных реакциях, осуществляя перенос электронов или ато­мов водорода от донора к акцептору. К ним относят дегидрогеназы, оксидазы (цитохромоксидаза, катал аза, пероксидаза и др.).

Трансферазы – катализируют процессы межмолекулярного переноса химических элементов. К ним относят фосфотранс-феразу, аденозинтрифосфатазу и др.

Гидролазы – катализируют гидролитическое расщепление пептидных, эфирных, гликозидных и других связей. К ним относят эстеразы (фосфатаза, ДНКаза, РНКаза и др.), карбогидразы (расщепляющие углеводы, например β-галактозидаза), протеазы (аминопептидазы, протеиназы, трипсин и др.), амидазы (уреаза, аргиназа и др.).

Лиазы – катализаторы реакции с присоединением по двой­ным связям и обратных реакций с отрывом этих групп. К ним относят декарбоксилазы, дезаминазы, альдолазу, фумаразу и т.д.

Изомеразы – катализируют процессы изомеризации при внутренней конверсии разных изомеров (геометрических изо­меров, изомеров оптических, изомеров положения). К ним относят глюкозо-6-фосфатизомеразу, рацемазу и др.

Лигазы (синтетазы) – катализируют связывание между со­бой молекул в реакциях расщепления пирофосфатной связи, например в молекуле АТФ. К ним относят глутаминсинтетазу, аспарагинсинтетазу, карбоксилазу и др.

Ферменты различаются по своей активности, которую из­меряют в МЕ – международных единицах. 1 МЕ соответствует количеству фермента, превращающего 1 микромоль субстрата В течение 1 мин. Активность ферментов зависит от температу­ры среды, рН, магнитного поля, других ферментов и т.д. Оп­тимальная величина рН для многих ферментов около 7,2–7,4. Оптимальная температура в пределах 37–50°С. Ферменты, ло­кализующиеся внутри клетки (в протоплазме, цитоплазматической мембране), называют эндоферментами (пептидаза и др.), а внеклеточно – экзоферментами (гидролазы, пермеазы и т.д.). Ферменты, постоянно образуемые в бактерии в определенной концентрации, независимо от веществ субстрата называют кон­ститутивными. Эти ферменты связаны в основном с клеточным обменом (протеазы, уреаза, липаза, карбогидраза). Индуцибельными называют ферменты, интенсивность синтеза которых рез­ко увеличивается при наличии субстрата β-лактамаза, разру­шающая пенициллин, β-галактозидаза, амилаза, расщепляю­щая крахмал, нитратредуктаза и т.д.).

Известна катаболитная репрессия синтеза ферментов ("глюкозный эффект"), которую наблюдают в тех случаях, когда в питательной среде содержится, помимо глюкозы или фрукто­зы, другой источник углерода (лактоза, арабиноза, галактоза, сорбитол, глицерол, ацетат и др.). Пока глюкоза присутствует в среде, не происходит синтеза фермента для утилизации дру­гих карбогидратов.

Важное место в процессах метаболизма отводится аллостерическим ферментам. Эти ферменты активно регулируют по­требности в конечных продуктах (регуляция "конечным про­дуктом"). Например, избыточное количество конечного про­дукта будет подавлять активность первого фермента, участвую­щего в биосинтезе продукта.

Помимо ферментов обмена веществ, патогенные микробы синтезируют "ферменты агрессии", относящиеся к факторам патогенности. Например, гиалуронидаза, расщепляющая меж­клеточное вещество соединительной ткани, продуцируется стрептококками и др.; фибринолизин растворяет фибрин, про­дуцируется гемолитическим стрептококком серогруппы А, па­тогенными стафилококками, клостридиями и др.; плазмокоагулаза коагулирует плазму, образуется патогенными стафилокок­ками и другими патогенами; гемолизин разрушает гемоглобин крови, образуется стрептококками, стафилококками, энтеро­кокками и др.; лецитиназа С – фермент-токсин, синтезируется многими патогенными бактериями; нейрамидаза разрушает связи в полисахаридах и углеводных компонентах сложных белковых соединений, образуется холерным вибрионом, диф­терийной палочкой, стрептококками и др.; лизоцим (мурами-даза) продуцируется некоторыми микроорганизмами, разруша­ет клеточные стенки бактерий.

Ферментный набор микробной клетки, подобно другим свойствам, всегда постоянен и контролируется геномом.