Белковой основой всех сред является питательный бульон; в зависимости от состава среды остальные ингредиенты добавляют к питательному бульону. Существует два способа приготовления основного питательного бульона: 1) на мясной воде с добавлением готового пептона – это так называемый мясопептонный бульон; 2) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина - бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена) или кислоты.
Приготовленные в лабораторных условиях гидролизаты разводят до нужного значения аминного азота (от 120 до 200 мг%) и добавляют входящие в рецептуру среды ингредиенты, предварительно отвешенные на лабораторных весах.
Растворение. Подготовленные навески ингредиентов помещают в стеклянную колбу или кастрюлю, доливают требуемое количество бульона или дистиллированной воды, кипятят на электрической плитке до растворения всех компонентов, устанавливают необходимое значение рН: сначала с помощью индикаторной бумажки, а затем потенциометра.
Фильтрование. Жидкие питательные среды фильтруют через двойной складчатый фильтр из фильтровальной бумаги, предварительно смоченной водой, или через фильтровальное полотно, которое накладывают на стеклянную воронку. Полотняные фильтры значительно практичнее бумажных, так как годны к употреблению в течение длительного времени, в то время как бумажные фильтры употребляются лишь однократно. Рекомендуется иметь отдельные полотняные фильтры для каждого вида среды.
Агаровые среды в расплавленном состоянии лучше всего фильтруются через ватно-марлевый фильтр: стеклянную воронку покрывают марлевой салфеткой такого размера, чтобы концы салфетки были перекинуты через края воронки наружу; затем на марлю кладут слой гигроскопической ваты, фильтр смачивают горячей дистиллированной водой. Агар наливают на фильтр горячим.
Желатиновую среду фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный дистиллированной водой. Желательно фильтрацию производить быстро в теплом помещении.
Розлив сред. После осветления и фильтрации питательные среды разливают в колбы, флаконы, пробирки, бутыли или матрацы.
Для разливки жидких питательных сред пользуются одной из описанных ниже установок.
- На конец воронки, закрепленной в кольце штатива, надевают резиновую трубку, оканчивающуюся стеклянным наконечником. На резиновую трубку накладывают зажим Мора. Под воронку подставляют сосуд для приема профильтрованной среды.
- • Для отмеривания и разливки определенных объемов среды пользуются градуированной бюреткой или собирают специальную установку (рис. 7.2). Стеклянную воронку и градуированную бюретку соединяют резиновыми трубками с двумя коленами стеклянного тройника, на третье его колено надевают резиновую трубку, заканчивающуюся стеклянным наконечником. На резиновые трубки, соединяющие воронку с тройником, и наконечник накладывают зажимы Мора. Ослабляя первый зажим, наполняют градуированный цилиндр жидкостью, затем, открыв второй зажим, выпускают отмеренное количество жидкости в сосуд для питательной среды. Первые порции жидкости до вытеснения воздуха из трубок не учитываются.
При розливе сред края посуды нельзя смачивать питательной средой, так как ватно-марлевые пробки, Приклеиваясь к стеклу во время стерилизации, вынимаются с трудом и оставляют в просвете отверстия сосуда остатки ваты. Попадая в среду, они могут вызывать загрязнение ее посторонней микрофлорой.
Поверх ватно-марлевой пробки на колбы и флаконы с питательными средами надевают бумажные колпачки.
Разливка плотных стерильных питательных сред в чашки Петри. Плотную питательную среду (агар, желатин) во флаконах или пробирках растапливают в водяной бане (сняв предварительно бумажные колпачки). Среду охлаждают до температуры 45–50 °С, сосуд берут в правую руку, левой рукой над огнем вынимают пробку и держат ее между мизинцем и ладонью, а края флакона или пробирки обжигают. Открытую посуду со средой держат в наклонном положении, чтобы избежать попадания в среду микробов из воздуха. В асептических условиях вносят стерильную кровь, сыворотку или другие необходимые добавки, тщательно перемешивают содержимое сосуда. Левой рукой приподнимают с одной стороны крышку чашки Петри и выливают в нее питательную среду в количестве 15–20 мл, слегка покачивая чашку, чтобы среда распределялась равномерным слоем по ее поверхности (рис. 7.3).
В настоящее время ряд фирм изготовляют приборы-автоматы для разливки агаризованных сред в чашки Петри, обеспечивающие высокую стерильность и точное дозирование разливаемых сред. Один из таких приборов изображен на рис. 7.4.
При застудневании агара образуется большое количество конденсационной воды, которая оседает на внутренней стороне крышки и увлажняет поверхность среды. В связи с этим перед посевом среды подсушивают: чашку в открытом виде помещают в термостат таким образом, чтобы крышка служила опорой для края ее дна, перевернутого средой вниз. Чтобы избежать образования конденсированной влаги, чашки с расплавленным агаром тотчас после заливки накрывают листом фильтровальной бумаги, которую стерилизуют вместе с чашкой. Бумага не должна касаться поверхности среды. Когда среда окончательно остынет, фильтровальную бумагу снимают, а чашки закрывают крышками.
Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав.
- Синтетические среды и все жидкие и агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре 121 °С.
- Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 110 – 112°С.
- Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость или антибиотики и другие добавки), стерилизуют фильтрованием или стерильные вещества добавляют в питательные среды ex tempore.
Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры, изготовляемые различными фирмами.
Приготовленные к употреблению стерильные питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при температуре 37 °С. Среды, простерилизованные в автоклаве, выдерживают в термостате 1 сут, простерилизованные текучим паром – 3 сут.