Этот метод основан на способности микроорганизмов, выдержавших стерилизацию, размножаться в стерилизованном молоке при оптимальных режимах термостатирования и вызывать в нем органолептические и физико-химические изменения.
Отобранные банки со сгущенным стерилизованным молоком выдерживают в термостате при 37±1 °С в течение 6 сут. По истечении этого срока банки с продуктом охлаждают до 20±5 °С и проводят внешний осмотр. При наличии вздутия крышки или донышка, не опадающего при нажатии пальцами, банку с продуктом считают бомбажной.
Банки без внешних дефектов вскрывают, сгущенное стерилизованное молоко анализируют органолептически, по показателям титруемой кислотности и микроскопически.
В сгущенном стерилизованном молоке после термостатирования не должно быть органолептических и физико-химических изменений, а в микроскопическом препарате не должно отмечаться бактериальных клеток.
Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Метод основан на способности мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при 30±1 °С в течение 72 ч.
Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения.
Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см3 в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито 10–15 см3 расплавленной и охлажденной до температуры 40–45 °С питательной среды для определения количества мезофильных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.
Допускается посев исследуемого продукта на чашки Петри из одного и того же разведения в количестве 1 и 0,1 см3. Сразу после заливки агара содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала.
После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в термостат с температурой 30±1 °С на 72 ч.
Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением в 4–10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами. При подсчете колоний рекомендуется пользоваться счетчиками.
При большом числе колоний и равномерном их распределении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний на двух-трех секторах (но не менее чем на Уз поверхности чашки), находят среднее арифметическое число колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.
Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 см3 или 1 г продукта (Х) в единицах вычисляют по формуле:
Х = n • 10m,
где n – количество колоний, подсчитанных на чашке Петри; m – число десятикратных разведений.
22.5.2. Определение бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)
Метод основан на способности БГКП (цитробактер, энтеробактер, клебсиелла, серация) сбраживать в питательной среде лактозу с образованием кислоты и газа при 37±1 °С в течение 24 ч.
По 1 см3 соответствующих разведений продукта засевают в пробирки с 5 см3 среды Кесслера (рецепт 120). Посев 10 см3 пастеризованного молока, 10 см3 закваски на чистых культурах, 3 см3 кефирной закваски или 10 см3 разведения 1:10 сгущенного молока и сливок с сахаром, какао и кофе со сгущенным молоком и сахаром в потребительской таре производится в колбочки с 40–50 см3 среды Кесслера.
Пробирки или колбы с посевами помещают в термостат при 37±1 °С на 18–24 ч. При исследовании мороженого пробирки с посевом выдерживают в термостате при 37±1 °С в течение 48 ч.
Просматривают пробирки или колбы с посевами. При отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов дают заключение об отсутствии в нем БГКП.
При наличии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов считается, что в нем обнаружены БГКП.
22.5.3. Определение Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах
Метод определения S. aureus с предварительным обогащением основан на высеве навески продукта и разведении его в жидкой селективной среде, инкубировании посевов, учете положительных пробирок (колб), пересеве на плотные селективные среды с последующим подтверждением принадлежности выросших колоний к S. aureus.
Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см3 в пробирки или колбочки с солевым бульоном (рецепт 15).
Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:10. Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре 37±1 °С в течение 24 ч.
Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне, к S. aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрда–Паркера (рецепт 156), желточно-солевой агар или мол очно-солевой агар (рецепты 80, 81).
Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре 37±1 °С в течение 24–48 ч. После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.
На желточно-солевом агаре колонии S. aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2–4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуются радужное кольцо и зона помутнения среды.
На мол очно-солевом агаре колонии S. aureus растут в виде непрозрачных, слегка выпуклых, круглых окрашенных колоний диаметром 2–4 мм.
На среде Байрда–Паркера колонии S. aureus растут в виде черных блестящих выпуклых колоний диаметром 1–1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1–3 мм.
С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных колоний и пересеивают на поверхность скошенного питательного агара, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37±1 °С в течение 24 ч. У выросших колоний определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика (см. гл. 6, 9).
Результаты оценивают по каждой пробе отдельно. Морфологические, культуральные свойства и положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствуют о присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта.
Метод определения количества S. aureus без предварительного обогащения основан на высеве продукта или его разведения на поверхность плотной среды, инкубировании, подсчете типичных колоний с последующим подтверждением выросших колоний по плазмокоагулирующей способности.
1 см3 жидкого продукта или его разведения наносят на поверхность питательных сред в 3 чашки Петри, тщательно растирают шпателем по поверхности питательной среды. Посевы инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 24–48 ч. Чашки Петри с посевами инкубируют дном вверх.
После термостатирования подсчитывают количество характерных колоний на каждой чашке Петри. С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных и(или) подозрительных колоний S. aureus, а в случае роста менее пяти – все колонии пересевают на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре 37±1 °С в течение 24 ч.
У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму и коагулирование плазмы кролика. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
Если при изучении характерных колоний в 80 % случаев, т.е. не менее чем в 4 из 5 колоний, подтвержден рост S. aureus, то считают, что все типичные колонии, выросшие на чашках Петри, принадлежат к этому виду. В остальных случаях количество S. aureus определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.
Количество колоний S. aureus в 1 г или 1 см3 после определения его в определенной навеске продукта вычисляют по формуле
где Σn1, Σn2– количество колоний, выросших на всех чашках Петри в пределах одного разведения или засеянного объема; n – число десятикратных разведений.
Определение сальмонелл, бактерий L. monocytogenes, дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочных продуктах изложены в общих требованиях к проведению микробиологического контроля пищевых продуктов.