Глубинный метод посева в плотные среды. Жидкий продукт или разведение навески вносят параллельно в две чашки Петри и заливают не позднее чем через 15 мин расплавленной и охлажденной до температуры 45±0,5 °С питательной средой. Высота слоя питательной среды должна быть 4–5 мм.
Среду немедленно равномерно перемешивают с посевным материалом круговыми движениями чашки так, чтобы среда не вытекла из чашки и не загрязнила крышку. После застывания среды чашки с посевами вверх дном помещают в термостат.
Поверхностный метод посева на плотные среды. Среду наливают в чашку Петри и после застывания подсушивают. Для удаления влаги с поверхности среды чашки открывают, переворачивают вверх дном и выдерживают в течение 30 мин при 48-50 °С.
На подсушенную среду наносят жидкий продукт или разведение навески и равномерно растирают по поверхности шпателем – изогнутой стеклянной палочкой.
Засеянную поверхность подсушивают, выдерживая чашки в горизонтальном положении в течение 15 мин.
Метод посева в жидкие среды. В колбу или пробирки с питательной средой вносят навеску продукта или разведения навески. При определении количества микроорганизмов питательные среды засевают продуктом и(или) разведениями навесок так, чтобы последовательно выдерживалась заданная кратность количества посевного материала.
Метод мембранных фильтров. Мембранные фильтры применяют для анализа легко фильтруемых жидких продуктов или продуктов, дающих растворы с высоким осмотическим давлением. При фильтрации раствора с высоким осмотическим давлением раствор предварительно разводят дистиллированной или пептонной водой в соотношении, позволяющем легко профильтровать разведенные растворы.
Жидкий продукт, содержащий небольшое число взвешенных частиц, фильтруют в два этапа. Для освобождения от частиц его фильтруют через фильтр со средним диаметром пор 4 мкм, а затем – через фильтр, диаметр и размеры пор которого выбраны в соответствии с группой или видом выявляемых микроорганизмов. Оба фильтра культивируют в аналогичных условиях.
После осаждения микроорганизмов на фильтре из растворов с высоким осмотическим давлением или из растворов, содержащих антимикробные вещества, его промывают дистиллированной водой или пептонно-солевым раствором.
Фильтрацию заканчивают в момент исчезновения влаги на поверхности фильтра. Немедленно после окончания фильтрации фильтр переносят на плотные или в жидкие питательные среды. На плотную среду фильтр накладывают нижней стороной так, чтобы она полностью соприкасалась с поверхностью среды. Посевы термостатируют в условиях, благоприятных для роста определяемых микроорганизмов.
Обработка результатов. После термостатирования, установленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания, подсчитывают количество колоний на каждой чашке, содержащей менее 300 колоний (или менее другого количества, установленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания).
В некоторых случаях подсчет колоний может быть затруднен (например, в присутствии инвазивных микроорганизмов). Эти случаи рассматриваются в соответствующих стандартах на конкретные методы испытаний.
Пример метода расчета (общий случай). Для получения достоверных результатов при подсчете количества колоний необходимо, чтобы хотя бы в одной чашке содержалось не менее 15 колоний. Количество микроорганизмов N в 1 г (см3) пробы вычисляют как средневзвешенное значение из подсчетов на двух последовательных разведениях по формуле
где ΣС – сумма колоний, подсчитанных на всех чашках в двух последовательных разведениях, из которых хотя бы одна чашка содержит не менее 15 колоний; V– объем посевного материала, внесенного в каждую чашку, см3; n1 – количество отобранных для подсчета чашек в первом разведении; n2 – количество отобранных для подсчета чашек во втором разведении; d – коэффициент разбавления, соответствующий первому разведению.
Результат вычисления округляют до двух значащих цифр. Для этого, если последняя цифра меньше 5, предшествующую цифру не изменяют; если последняя цифра равна или более 5, предшествующую увеличивают на единицу. Округление проводят поэтапно до получения двух значащих цифр.
За результат принимают количество микроорганизмов в 1 см3 (жидкие продукты) или в 1 г (прочие продукты), выраженное в виде числа от 1,1 до 9,9, умноженного на 10 в соответствующей степени.
ПРИМЕР.
Округление результата дает 19 000, или 1,9·104 микроорганизмов в грамме продукта.
Метод расчета при проведении идентификации. Если используемый метод требует идентификации, определенное количество колоний (обычно 5) пересевают с каждой чашки, отобранной для подсчета колоний. После идентификации рассчитывают для каждой чашки количество идентифицированных микроорганизмов а по формуле
где А – количество колоний, отобранных для идентификации; b – количество колоний, соответствующих критериям идентификации; С – общее количество колоний.
Результат вычисления округляют до целого числа.
Количество N идентифицированных микроорганизмов, присутствующих в 1 г (см3) испытуемой пробы, рассчитывают как средневзвешенное значение, заменив ΣС на Σa.
ПРИМЕР.
Прямой подсчет жидкого продукта дал следующие результаты:
- в первом выбранном разведении (10-3) в двух чашках выявлено соответственно 66 и 80 колоний;
- во втором выбранном разведении (10-4) – 4 и 7 колоний.
Результаты идентификации:
- из чашки с 66 колониями для идентификации отобрано 8 колоний, из которых 6 соответствовали критериям; следовательно, а = 50;
- из чашки с 80 колониями отобрано 9 колоний, из которых 6 соответствовали критериям; следовательно, а = 53;
- из чашки с 7 колониями отобрано 5 колоний, из которых 4 соответствовали критериям; следовательно, а = 6;
- из чашки с 4 колониями все 4 идентифицированы положительно; следовательно а = 4.
Таким образом, количество обнаруженных в пробе микроорганизмов составляет 5,1·104 в 1 см3.
Приближенные оценки количества микроорганизмов.
Если в каждой из двух чашек содержится менее 15 колоний на уровне исходной пробы (жидкие продукты) или исходной суспензии (прочие продукты), то рассчитывают среднее арифметическое у колоний, подсчитанных на этих чашках.
Результат выражают следующим образом:
- для жидких продуктов – приближенное количество микроорганизмов в 1 см3 NE= Υ,
- для прочих продуктов – приближенное количество микроорганизмов в 1 г Ng = Υ/d, где d – коэффициент разбавления исходной суспензии.
Если две чашки не содержат колоний на уровне исходной пробы (жидкие продукты) или исходной суспензии (прочие продукты), то результаты выражают следующим образом:
- менее 1 микроорганизма в 1 см3 (жидкие продукты);
- менее 1/d микроорганизмов в 1 г (прочие продукты), где d – коэффициент разбавления исходной суспензии.
Метод подсчета с использованием жидкой среды. Метод наиболее вероятного числа (НВЧ). Возможны два способа посева.
В наиболее часто используемом способе, называемом "симметричным", применяется одинаковое количество пробирок в каждом разведении, объемы соседних разведений обычно соотносятся как 1:10. Этот способ используют, если нужно определить не только превышение определенных предельных норм, но и количество присутствующих микроорганизмов.
Используют также способ, называемый "асимметричным", который предусматривает разное количество пробирок в отдельных разведениях.
В действующих стандартах рассматривается только "симметричный" способ с десятикратными разведениями.
В зависимости от требуемой точности результатов засевают необходимое количество флаконов или пробирок одним и тем же разведением (например, три, пять или десять). Как правило, применяемые методы требуют трех пробирок или флаконов на разведение.
Значения индекса НВЧ для приемлемых сочетаний находят по табл. 22.1. С помощью индекса НВЧ определяют наиболее вероятное количество микроорганизмов СS в заданном объеме VS по Формуле
где М – индекс НВЧ, взятый из табл. 22.1 для базового разведения V0; F – число, обратное коэффициенту разбавления исходной пробы. Это разведение (1,0) использовано в табл. 22.1 как базовое разведение (обычно F = 10,100 и т.д.); VS – заданный объем, выбранный для выражения содержания микроорганизмов; V0 - объем, использованный для посева базового разведения.
Если наименьшее разведение из отобранных соответствует пробирке, приготовленной из среды двойной концентрации (посев 10 см3), индекс НВС, взятый из табл. 22.1, делят на 10.
Если НВЧ меньше 0,3 микроорганизма в 1 см3 (жидкие продукты) или в 1 г (другие продукты) и если была использована методика, предназначенная для малых количеств микроорганизмов, результаты должны выражаться следующим образом: менее 1 микроорганизма в 1 см3 для жидких продуктов или 1 г для прочих продуктов.
ПРИМЕР.
Для твердого продукта установлен индекс НВС, равный 24; первая выбранная пробирка соответствует посеву 1 см3 исходной суспензии (F = 10), отсюда СS в 1 г составляет
Число положительных пробирок трех выбранных разведений |
НВЧ микроорганизмов |
Категория оценки для одновременно проанализированных проб в количестве |
Действительное число микроорганизмов в 1 (см3) с вероятностью |
|||||||||
95% |
99 % |
|||||||||||
1,0 |
0,1 |
0,01 |
1 |
2 |
3 |
5 |
10 |
от |
до |
от |
до |
|
2 |
2 |
1 |
2,8 |
3 |
2 |
2 |
2 |
1 |
0,9 |
9,4 |
0,5 |
14,2 |
2 |
2 |
2 |
3,5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
3 |
0,9 |
9,4 |
0,5 |
14,2 |
2 |
3 |
0 |
2,9 |
3 |
2 |
2 |
2 |
1 |
0,9 |
9,4 |
0,5 |
14,2 |
2 |
3 |
1 |
3,6 |
0 |
3 |
3 |
3 |
3 |
0,9 |
9,4 |
0,5 |
14,2 |
3 |
0 |
0 |
2,3 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0,5 |
9,4 |
0,3 |
14,2 |
3 |
0 |
1 |
3,8 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0,9 |
10,4 |
0,5 |
15,7 |
3 |
0 |
2 |
6,4 |
3 |
3 |
2 |
2 |
2 |
1,6 |
18,1 |
1,0 |
25,0 |
3 |
1 |
0 |
4,3 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
0,9 |
18,1 |
0,5 |
25,0 |
3 |
1 |
1 |
7,5 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1,7 |
19,9 |
1,1 |
2710 |
3 |
1 |
2 |
12 |
3 |
2 |
2 |
2 |
1 |
3 |
36 |
2 |
44 |
3 |
1 |
3 |
16 |
0 |
0 |
0 |
3 |
3 |
3 |
38 |
2 |
52 |
3 |
2 |
0 |
9,3 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1,8 |
36,0 |
1,2 |
43,0 |
3 |
2 |
1 |
15 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
3 |
38 |
2 |
52 |
3 |
2 |
2 |
21 |
2 |
1 |
1 |
1 |
1 |
3 |
40 |
2 |
56 |
3 |
2 |
3 |
29 |
3 |
3 |
3 |
2 |
2 |
9 |
99 |
5 |
152 |
3 |
3 |
0 |
24 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
4 |
99 |
5 |
152 |
3 |
3 |
1 |
46 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
9 |
198 |
5 |
283 |
3 |
3 |
2 |
110 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
20 |
400 |
10 |
570 |
3 |
3 |
3 |
<110 |
Метод обнаружения. Метод обнаружения – это метод, который определяет наличие или отсутствие микроорганизмов в заданном объеме продукта. Если не установлено иное вы конкретных стандартах на методы испытаний, количество Р испытываемого продукта смешивают (жидкие продукты) или гомогенизируют (прочее продукты) с 9 см3 или 1 г элективной либо селективной среды. Все среды применяют в расплавленном виде. После термостатирования на поверхности селективной агаровой среды получают несколько изолированных колоний (обычно пять) и подвергают их идентификации.
Иногда имеет смысл использовать для тех же целей две или более элективные или селективные жидкие среды, а также две или более селективные агаровые среды. Если обнаружен микроорганизм, то указывают, в какой навеске исследуемого продукта.