Оборудование
Спектрофотометр-нефелометр
Хемилюминометр
Лабораторный микроскоп
Люминесцентный микроскоп
Центрифуга с горизонтальным ротором для выделения клеточных популяций
96-луночные круглодонные и плоскодонные планшеты для иммунологических исследований
Титровальные планшеты
Автоматические пипетки-дозаторы с регулируемым объемом
на 10-50; 20-100; 100-500; 1000-5000 мкл
Пастеровские пипетки
Денситометр
Водяная баня
Магнитная мешалка
Камера Горяева
Счетчик форменных элементов крови
Пластиковые пробирки объемом 12 мл
Центрифужные пробирки
Термостат
СО2-инкубатор
Холодильник
Приготовление рабочих реактивов для микрометода определения компонентов комплемента
Буфер хранить в холодильнике. Для приготовления рабочего раствора буфера (РРБ) к одному объему 5-кратного буфера добавить 4 объема дистиллированной воды.
Раствор "Глюгицир" для хранения эритроцитов (Гематологический научный центр, Москва).
Гемолитическая сыворотка (НПО "Биомед", Пермь) перед проведением реакции разводится РРБ так, чтобы ее титр в 3 раза (тройной титр) превышал рабочий титр, указанный на этикетке. Например, при рабочем титре 1:3000 сыворотку следует разводить в 1000 раз.
Стандартную взвесь эритроцитов барана (109 кл/мкл) готовят из отмытых несколько раз холодным рабочим раствором веронал-мединалового буфера, центрифугируя по 5 мин при 3000 об/мин до получения совершенно бесцветной надосадочной жидкости. Лучше всего эритроциты барана в растворе "Глюгицир" залить РРБ и оставить на ночь в холодильнике до полного отстаивания. Надосадок осторожно собрать пипеткой. К 1 объему осадка добавить 17 объемов РРБ. Для стандартизации взвеси эритроцитов барана 0,2 мл суспензии лизируют 2,8 мл дистиллированной воды. Оптическая плотность (ОП) лизата должна равняться 0,7 при длине волны 541 нм (в кювете толщиной 1 см против воды), что по концентрации гемоглобина соответствует примерно 109 кл/мл.
Если ОП отличается от 0,7, то конечный объем, до которого необходимо развести имеющийся объем взвеси (Уисходн), определяют по формуле:
Если ОП больше 0,7, то к исходному объему взвеси добавляют РРБ до конечного объема, если ОП ниже 0,7, то необходимый объем буфера отбрасывают после центрифугирования взвси.
Приготовление рабочей суспензии ЕА-комплекса (сенсибилизированных эритроцитов) в концентрации 1,5-108 кл/мкл. К 10 мл взвеси отмытых, как описано выше, эритроцитов барана в концентрации 1∙109 кл/мл добавляют 10 мл гемолитической сыворотки, разбавленной РРБ согласно наставлению по применению, тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин при 37°С, периодически перемешивая. Взвесь доводят до концентрации 1,5∙108 кл/мкл, добавляя 46,7 буфера. Смесь 0,2 мл сенсибилизированных эритроцитов с 2,8 мл воды должна иметь поглощение 1,0 при длине волны 412 нм. Эритроциты хранят в течение 7 сут при температуре 6±2 °С и перед каждой постановкой отмывают РРБ и стандартизуют.
Подготовка сухих реагентов. Реагенты представляют собой лиофилизированную сыворотку крови человека, в которой отсутствует тестируемый компонент. Реагенты выпускают во флаконах по 0,5 и 1,0 мл. Комплект состоит из 5 флаконов для определения активности С1, С2, СЗ, С4 и С5-компонентов комплемента. Реагенты растворяют дистиллированной водой при легком встряхивании до объема, указанного на этикетке. Непосредственно перед титрованием готовят рабочее разведение реагентов с помощью РРБ, как указано на этикетке.
Растворы, реактивы
Фосфатный буфер (рН 7,2) на тридистиллированной авто-клавированной воде:
7,0 г NaС1
2,0 г Na2НРO4
0,3 г КН2РО4 до 1000 мл Н2O.
0,1 М веронал-мединаловый буфер (рН 8,6)
0,8 г веронала растворить при нагревании в 700 мл дистиллированной воды, добавить 4,5 г мединала и общий объем довести до 1 л.
Приготовление реактивов для исследования фагоцитарной активности нейтрофилов и субпопуляций лимфоцитов
Гепарин: 1 мл стандартного раствора с активностью 5000 ЕД в 1 мл разводят в 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия (1,0 мл концентрированного гепарина смешивают с 9,0 мл изотонического раствора хлорида натрия). Хранят в холодильнике. При взятии крови в пробирку вносят 0,2 мл (200 мкл) разведенного гепарина и 10 мл венозной крови. Конечная концентрация – 10 ЕД в 1 мл крови.
Инкубационная среда – 20 % раствор сыворотки крупного рогатого скота на 0,85 % стерильном растворе №С1 готовят в день проведения исследования. Не хранить!
Раствор Хенкса без фенолового красного (НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва).
Раствор нитросинего тетразолия для НСТ-теста: 4 мг НСТ ("Sigma", мол.м. 817,6) смешивают с 1 мл фосфатного буфера (рН 7,2–7,4) или стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Для лучшего растворения помещают в термостат на 30–40 мин при 37°С. Фильтруют! Готовят непосредственно перед использованием. Необходимый объем раствора определяют исходя из числа исследуемых образцов крови.
Краситель – 1 % раствор метилового зеленого: 1 г метилового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют и хранят в холодильнике. Недостаточно очищенный краситель имеет фиолетовый цвет, от которого можно избавиться, экстрагируя примеси хлороформом. Для этого смешать водный раствор красителя с равным объемом хлороформа и после расслоения аккуратно слить водную часть. Повторить 2–3 раза до получения чистого зеленого цвета красителя. Процедуру проводить в вытяжном шкафу.
Опсонизированный зимозан. Используется зимозан, выпускаемый для определения пропердина (НПО "Биохим-реактив", Олайне). Готовят смесь сывороток 10 доноров. Готовят навеску зимозана из расчета 20 мг на 1 мл сывороточного пула.
Зимозан суспендируют в изотоническом растворе хлорида натрия (на 1 г зимозана – 100 мл раствора) и кипятят на водяной бане 30 мин. Отмывают центрифугированием два раза 0,85 % раствором хлорида натрия и добавляют к свежеприготовленной сыворотке 10 доноров до конечной концентрации 20 мг/мл, инкубируют 45 мин при 37°С, периодически встряхивая. Затем трижды отмывают путем центрифугирования раствором без кальция и магния, чтобы избежать агрегации клеток и ресуспендируют взвесь до первоначального объема. Приготовленный зимозан разливают на аликвоты по 250 мкл и хранят при – 40–70°С на протяжении нескольких месяцев.
Раствор для отмывания клеток без Са2+ и Mg2+.
NaCl 8 г, KCl 0,4 г, Na2HPO4 0,4 г, К2РO4 0,4 г, 1 г глюкозы, 2,7 г HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N12-этансульфоновой кислоты) дистиллированной воды до 1 л (pH 7,0). Все растворы стерилизуют через мембранный фильтр.
Взвесь латекса с размером частиц 0,8–1,4 мкр для исследования поглотительной активности нейтрофилов готовят на фосфатном буфере или на стандартном растворе Хенкса из стандартной 10 % взвеси. Рабочая концентрация латекса – 0,1 % (0,1 мл 10 % взвеси разводят в 10 мл буфера или раствора Хенкса).
Раствор фиколла и верографина (или урографина) для выделения клеток. Градиент с плотностью 1,076 г/см2 готовят следующим образом: к 20 г фиколла ("Pharmacia", Швеция) добавить 50 мл 76 % раствора урографина (ФАО "Ферейн", Россия) и 280 мл дистиллированной воды.
Градиент с плотностью 1,118 г/см2 готовят из предыдущего раствора с плотностью 1,076 г/см2, добавляя в него 76 % раствор урографина под контролем ареометра.
Рабочий раствор люминола для ХЛ анализа. 0,56 мМ люми-нола ("Aldrich", США) готовят следующим образом: 10 мг люминола растворяют в 80 мл раствора Хенкса без фенолового красного на магнитной мешалке в течение 18 ч в темноте при комнатной температуре, затем раствором Хенкса доводят объем до 100 мл. Разливают на аликвоты по 3 мл и хранят при температуре от –18 до –20 °С в течение нескольких месяцев.
0,5 % краситель генциановый фиолетовый на 3 % уксусной кислоте для подсчета лейкоцитов готовят следующим образом: 3 мл ледяной уксусной кислоты (МХК "Лаверна", Москва) переносят в 97 мл дистиллированной воды, добавляют 0,5 г генцианового фиолетового (МХК "Лаверна", Москва) и растворяют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч при комнатной температуре, фильтруют через бумажный фильтр и хранят в холодильнике несколько месяцев.
Приготовление агара для реакции иммунодиффузии
Для получения 1,5 % агара навеску добавить в соответствующий объем 0,1 М веронал-мединалового буфера. Колбу со смесью помещают в кипящую водяную баню, смесь периодически перемешивают, не позволяя агару оседать на дно. Агар считается готовым, когда он приобретает стекловидную прозрачность.
Материалы для исследования ИФ-статуса
Среда Игла однократная или двойная
Среда RPMI-1640
Гентамицин (0,08 мг/мл)
Глутамин (0,3 мг/мл)
Бычья сыворотка – 2% в среде
Культура клеток фибробластов человека М19
Вирус болезни Ньюкасла, штамм Канзас (ВБН)
Вирус везикулярного стоматита, штамм Индиана (ВВС)
Фитогемагглютинин Р (ФГА), "Difco", США
Поли(И).поли(Ц), "Sigma", США
ДЭАЭ-декстран, "Upsula", Швеция
Гепарин
1 N HCl, 1 N NaOH
Индикаторная бумага
Референс человеческого ИФ-α, ИФ-ß, ИФ-γ
Антисыворотки к человеческим ИФ-α, ИФ-ß, ИФ-γ