Основным принципом оценки результатов комплексного исследования иммунного статуса является определение количественных и функциональных параметров всех его звеньев и их сравнение с нормальными величинами. Наиболее часто встречающимися изменениями являются иммунодефицит, т.е. нарушения нормального иммунологического статуса, обусловленные дефектами одного или нескольких механизмов иммунного ответа.
В набор тестов для оценки состояния иммунной системы должны входить методы определения количества нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, поглотительной и бактерицидной активности лейкоцитов и их способности образовывать активные формы кислорода, концентрации иммуноглобулинов классов IgA, IgG, IgM, IgE, гемолитической активности комплемента, популяций и субпопуляций лимфоцитов, цитокинового статуса.
16.2.1. Оценка клеточного звена иммунной системы
Для характеристики клеток системы иммунитета используют:
- определение их общего количества по наличию маркера на поверхности клеток;
- оценку их функции по выработке цитокинов, медиаторов и других продуктов in vitro.
Для выявления клеток иммунной системы используется определение на их поверхности дифференцировочных антигенов – CD (Cell Differentiation antigens) с помощью монокло-нальных антител, меченных флюоресцирующими красителями. Основные маркеры лимфоцитов представлены в табл. 16.4.
Таблица 16.4. Дифференцированные антигены лимфоцитов человека
Рецепторы |
Определяемый тип клеток |
CD3 |
Зрелые Т-лимфоциты |
CD4 |
Т-хелперы/индукторы |
CD8 |
Т-супрессоры/цитотоксические |
CD16 |
N10-клетки |
CD19 |
Незрелые и зрелые В-лимфоциты |
CD20 |
Зрелые В-лимфоциты |
CD25 |
Активированные Т-клетки |
CD95 |
Fas-положительные клетки (рецептор, опосредующий апоптоз) |
Для определения количества основных популяций и субпопуляций лимфоцитов используют метод визуального подсчета клеток с помощью люминесцентного микроскопа или автоматического проточного цитофлюориметра.
Для идентификации поверхностных структур лимфоцитов и других клеток в основном используют две группы методов: 1) розеткообразование; 2) методы иммунофлюоресценции.
16.2.1.1. Техника подготовки пробы и подсчета основных популяций лимфоцитов иммунофлюоресцентным методом
- • Выделение лимфоцитов из цельной гепаринизированной крови проводят на фиколл-верографиновом (урографиновом) градиенте плотности 1,077 г/мл (см. раздел 16.4) с помощью центрифугирования в течение 30 мин при 1500 об./мин с последующим двукратным отмыванием концентрата лимфоцитов раствором Хенкса.
- После подсчета количества лимфоцитов в камере Горяева (достаточным для проведения методики считается 3000– 15000кл/мкл) взвесь клеток вносят по 50 мкл в лунки 96-луночного планшета. Количество лунок соответствует количеству используемых моноклональных антител против дифференцировочных антигенов лимфоцитов.
- После осаждения к клеткам добавляют по 20 мкл соответствующих антител. После инкубации при 4° в течение 35– 40 мин во все лунки добавляют по 150 мкл раствора Хенкса и отмывают клетки центрифугированием при 200 об./мин в течение 5 мин с последующим удалением супернатанта. Отмывание повторяют трижды.
- К осадку отмытых клеток добавляют по 20 мкл ФИТЦ-ме-ченных конъюгатов (вторичных овечьих антител к мышиным иммуноглобулинам в разведении 1:100). Для разведения используют 0,1 % раствор азида натрия в растворе Хенкса. Клетки ресуспендируют и инкубируют 30 мин при 4 °С.
- После двукратного отмывания клетки переносят на предметное стекло и подсчитывают под покровным стеклом на люминесцентном микроскопе с иммерсией. Учитывают количество светящихся клеток на каждые 200 лимфоцитов. Рассчитывают относительное (%) и абсолютное (кл/мкл) число лимфоцитов. Если результаты тестов будут учитываться через несколько часов, то клетки необходимо зафиксировать. Для этого после заключительного центрифугирования и удаления супернатанта к осадку клеток добавляют 50 мкл 1% раствора параформальдегида на фосфатносолевом буфере. Фиксированные клетки сохраняют флюоресценцию в течение недели.
Для микроскопирования клетки в каждой лунке суспендируют, переносят на отдельные предметные стекла, накрывают покровными и просматривают под иммерсией на люминесцентном микроскопе (объектив ×90).
Выделение лимфоцитов для автоматического подсчета на проточном цитофлюориметре проводится на градиенте плотности, как описано выше, так и путем лизиса эритроцитов специальными стандартными реагентами, выпускаемыми фирмами–производителями реактивов для типирования клеток в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Метод проточной лазерной фотометрии является универсальным и позволяет не только получить детальные характеристики клеточных суб-популяций, но и проводить их препаративное разделение. Прежде всего на основе анализа светорассеяния в исследуемом образце определяют содержание лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов. Используя прямой или непрямой метод флюоресценции, определяют численность различных субпопуляций лимфоцитов в соответствии с использованными меченными флюоресцеином специфическими моноклональными антителами. Помимо регистрации свечения, возможна оценка его интенсивности. Обработка полученных результатов проводится по специальной программе, встроенной в прибор.
16.2.1.2. Техника определения функциональной активности нейтрофилов
Для оценки нарушений в системе фагоцитоза существуют различные методы, с помощью которых можно выявить функциональные нарушения на всех стадиях процесса. Однако в клинической практике в настоящее время широко применяются те из них, с помощью которых изучаются только три последние стадии – поглощение и переваривание микроорганизмов, а также продукция бактерицидных метаболитов кислорода. Принцип этих методов состоит в подсчете лейкоцитов, фагоцитирующих микробные клетки (чаще всего S. aureus 209Р) или частицы (чаще всего латекса диаметром 0,8–1,2 р или зимозана). Для определения бактерицидной активности чаще всего применяют варианты теста восстановления нитро-синего тетразолия (НСТ-тест) и методы хемилюминесцентного анализа (ХЛ-анализ), которые позволяют определить количество клеток, продуцирующих метаболиты кислорода, и динамику этого процесса.
В целях получения большого числа нейтрофильных гранулоцитов, что существенно ускоряет процесс их подсчета в мазках, все варианты методов оценки фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофилов целесообразно проводить с лейкоцитарным концентратом. Для его получения в пробирку вносят 0,2 мл раствора гепарина с активностью 5000 ЕД/мл, разведенного изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:9, добавляют 5 мл венозной крови и перемешивают. Затем гепа-ринизированную кровь центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин до ее разделения на клеточный и плазменный слои. Пастеровской пипеткой осторожно отсасывают плазму и снимают средний слой лейкоцитов. Полученную лейкоцитную массу используют для определения поглотительной и бактерицидной активности нейтрофилов.
Постановку реакции удобно проводить в 96-луночных планшетах для иммунологических исследований, что позволяет экономно расходовать реагенты. Для определения поглотительной активности нейтрофилов в лунку планшета вносят 50 мкл 0,1 % взвеси латекса и 50 мкл клеточной взвеси, обогащенной лейкоцитами (получают из интерфазы между плазмой и эритроцитами после центрифугирования гепаринизированной крови). Параллельно целесообразно определять активность кислородного метаболизма (бактерицидность) нейтрофилов с помощью НСТ-теста. Для этого в две соседние лунки вносят по 50 мкл клеточной суспензии, а затем в одну из них, для определения спонтанной активности кислородного метаболизма, вносят 50 мкл 0,1 % раствора нитросинего тетразолия (НСТ), а во вторую, для исследования индуцированной активности, – по 25 мкл 0,1% взвеси латекса с диаметром частиц 0,8–1,4 ц. и 0,2 % раствора НСТ.
Смеси тщательно перемешивают и инкубируют в течение 30 мин. По окончании инкубации на предметных стеклах делают 3 мазка – по одному мазку из каждой лунки. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют 20 мин 96 % этиловым спиртом и окрашивают метиловым зеленым[1].
Для подсчета клеток используют масляную иммерсию и объектив ×100.
При учете результатов латекс-теста подсчитывают относительное количество фагоцитирующих клеток в процентах (количество нейтрофильных гранулоцитов, содержащих в цитоплазме не менее 3 частиц латекса среди 100 нейтрофилов) и абсолютное количество, исходя из абсолютного числа нейтрофилов в 1 мкл крови.
Учет результатов НСТ-теста. При определении спонтанной активности кислородного метаболизма нейтрофилов в мазке из лунки с раствором НСТ подсчитывают количество лейкоцитов с четкими сине-фиолетовыми гранулами диформазана в цитоплазме среди 100 лейкоцитов. Результат выражают в относительных (%) и абсолютных количествах НСТ-положи-тельных клеток в 1 мкл крови (кл/мкл). Абсолютное количество подсчитывают по формуле:
где Лц – абсолютное количество лейкоцитов в венозной крови (в кл/мкл), Нф – относительное количество нейтрофильных гранулоцитов (в %), НСТ – относительное количество нейтрофилов с гранулами диформазана в цитоплазме (в %).
Учет результатов активированного латексом НСТ-теста проводят аналогичным образом, подсчитывая среди 100 гранулоцитов как клетки с частицами латекса и диформазана, так и клетки только с частицами диформазана в цитоплазме (акт. НСТ+-клетки).
Результат выражают в относительном (%) и абсолютном (кл/мкл) количестве клеток. Абсолютное количество подсчитывают по формуле:
где Лц – абсолютное количество лейкоцитов в венозной крови (в кл/мкл), Нф – относительное количество нейтрофильных гранулоцитов (в %), а.НСТ – относительное количество нейтрофилов с гранулами диформазана в цитоплазме в активированном НСТ-тесте (в %).
Хемилюминесцентный анализ нейтрофилов цельной крови проводят с помощью хемилюминометра, например "Люцифер" (СП "Диалог", Москва), управляемого от IВМ-компьютера по специальной программе. Для анализа используют стабилизированную гепарином венозную кровь, разбавленную в 11 раз раствором Хенкса без фенолового красного. Регистрацию спонтанной хемилюминесценции (ХЛ) проводят в течение 40 мин в макрокюветах с повышенной прозрачностью (СоШагсИ, Италия), в которые вносят по 200 мкл 0,56 мМ раствора люминола (Аldrich, США) и по 200 мкл разбавленных образцов крови. Затем в кюветы вносят по 50 мкл суспензии опсонизирован-ного зимозана (НПО "Биохим-реактив", Олайне) и продолжают регистрацию ХЛ еще в течение 40 мин. После этого содержимое кювет перемешивают и для подсчета количества клеток 200 мкл суспензии переносят в лунки планшета для иммунологических исследований, содержащих по 50 мкл 0,5 % раствора генцианового фиолетового в 3 % растворе уксусной кислоты. В камере Горяева подсчитывают общее количество лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов, фагоцитировавших зимозан. Определение абсолютного количества клеток в кювете проводят по формуле:
где А – число клеток в 100 больших квадратах камеры Горяева; р – разведение суспензии окрашенных клеток; w – объем суспензии клеток в макрокювете люминометра в мкл; b – сторона большого квадрата камеры Горяева в мм; h – глубина камеры Горяева в мм; n – количество больших квадратов, в которых подсчитаны клетки.
Для оценки функциональной активности нейтрофилов с помощью ХЛ учитывают следующие параметры:
- количество нейтрофилов в анализируемом образце крови (КН);
- количество фагоцитирующих зимозан нейтрофилов (КФН) в анализируемом образце крови;
- максимальная амплитуда спонтанной ХЛ (МАсп) – интенсивность свечения в анализируемом образце крови при спонтанной активации окислительного метаболизма лейкоцитов (имп. х 5 с);
- максимальная амплитуда индуцированной ХЛ (МАинд) – интенсивность свечения в образце крови при активации (зи-мозан) окислительного метаболизма нейтрофилов (имп. х 5 с);
- коэффициент стимуляции (КС) – отношение МАинд к МАсп;
- удельная спонтанная ХЛ нейтрофилов (Усп) – отношение МАсп к КН за единицу времени (имп/мин/тыс. кл), рассчитывается по формуле:
- удельная индуцированная ХЛ нейтрофилов (Уинд) – отношение МАинд к КФК за единицу времени (имп/мин/ тыс. кл) рассчитывают по формуле:
16.2.2. Оценка гуморального звена иммунной системы
Для обнаружения в сыворотке крови иммуноглобулинов или антител к тому или иному микроорганизму или тканевому антигену применяют различные серологические методы, позволяющие визуализировать образование комплекса антиген-антитело. Основным условием является специфичность антигена, используемого в диагностической тест-системе или для иммунизации животных в целях получения антител.
16.2.2.1. Принципы методов определения антител в биологических жидкостях
Преципитация в растворах или в геле – наиболее простые, но и наименее чувствительные методы выявления антигенов или антител. В целом преципитация в растворах служит для определения титра антител, при этом растворимый антиген в постоянной дозе добавляют к исследуемой сыворотке, взятой в последовательных двукратных разведениях 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. Картину преципитации оценивают или визуально, или с помощью нефелометрии по степени помутнения раствора.
При постановке метода преципитации в геле один из двух реагентов включают в агар (обычно это специфические антисыворотки), другой реагент (антиген) в двукратных разведениях вносят в лунки, откуда он диффундирует в агар. При оптимальном соотношении антигена и антитела образуется преципитат, видимый невооруженным глазом.
Для диагностики инфекционных заболеваний более широкое распространение получили методы, основанные на феномене агглютинации. В отличие от реакции преципитации при вррпотинации антиген представлен в корпускулярной форме (прямая агглютинация эритроцитов или бактерий) либо связан с частицами носителя (эритроциты, латекс) – непрямая, или пассивная, агглютинация. Связывание антигена на микроскопическом носителе послужило первым шагом на пути совершенствования метода, в частности привело к значительному повышению его чувствительности по сравнению с общепринятой реакцией преципитации. Было установлено, что многие антигены бактерий способны спонтанно или посредством предварительной обработки танином, бензидином или глута-ровым альдегидом адсорбироваться на эритроцитах.
Специфичность реакции агглютинации тем выше, чем чище антиген, использованный для сенсибилизации эритроцитов. Конкуренция смеси антигенов (например, в гомогенате бактерий) за поверхность эритроцитов снижает воспроизводимость метода и часто увеличивает вероятность неспецифических реакций. Чувствительность агглютинации значительно варьирует при использовании разных систем антиген–антитело, кроме того, иммуноглобулины известных классов обладают разными агглютинационными свойствами. Так, способность к агглютинации у молекул IgM в 60–180 раз выше, чем у молекул IgG.
При помощи реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) можно определять до 3–6 нг азота антител. По чувствительности РПГА равна или значительно превосходит реакцию связывания комплемента. Учитывая, что РПГА более чувствительна в отношении иммуноглобулинов класса М, чем класса G, становится ясным, что изменение титра РПГА связано не только с количеством антител, но и с их составом. Различия результатов титрования высоко- и низкоаффинных антител могут быть уравнены путем большей антигенной нагрузки эритроцитов. В связи с этим очень важным параметром соединения антигена с эритроцитами является плотность антигенных детерминант. Оптимальное количество антигена для "нагрузки" эритроцитов то, которое дает максимальный титр антител.
Спонтанно связываются с эритроцитами только бактериальные антигены полисахаридной природы. Антигены белковой природы адсорбируются на поверхности эритроцита очень слабо, поэтому для обеспечения связывания крупномолекулярных белковых антигенов на эритроцитах последние предварительно обрабатывают танином. Белки, богатые тирозином и гистидином, лучше связываются с эритроцитами, обработанными бензидином, а для конъюгирования белков, богатых аминогруппами, лучше всего применять глутаровый альдегид, который, кроме того, препятствует спонтанной агглютинации эритроцитов в процессе хранения. Во всех случаях предварительная обработка эритроцитов способствует уплотнению и модификации наружной мембраны эритроцитов, повышая ее адсорбционные способности.
Подобно преципитации метод непрямой гемагглютинации используется как полуколичественный анализ, с помощью которого определяют то максимальное разведение сыворотки, при котором еще возможна агглютинация (титры антител). Результаты можно оценить макроскопически. Реакцию проводят в макро- или микротитровальных планшетах. Микротитрование требует меньшего количества времени и материалов, но оно сопряжено с большей вероятностью ошибок, особенно при использовании больших разведений антител. Для достоверности РПГА необходимы ежедневные позитивные и негативные контроли, которые исключают бактериальное загрязнение суспензии эритроцитов и антисывороток. Техника постановки РПГА будет описана далее.
Для выявления антигенов микроорганизмов применяется также реакция связывания комплемента (РСК), основанная на том, что комплемент принимает участие в многочисленных реакциях связывания антигена с антителом. Постановку опыта осуществляют в два этапа. На первом этапе исследуемую сыворотку и известный антиген инкубируют с комплементом. На втором этапе к смеси реагентов добавляют индикаторную систему, состоящую из гемолитической сыворотки и эритроцитов. При взаимодействии антигена с антителом на первом этапе комплемент связывается и не может участвовать в гемолитической реакции на втором этапе, поэтому гемолиз отсутствует или выражен незначительно. Если комплекс антиген–антитело не образуется, комплемент полностью включается в индикаторную систему, что сопровождается полным гемолизом. Эта реакция обладает достаточно высокой чувствительностью и применяется для диагностики сифилиса, вирусных инфекций и некоторых аутоиммунных заболеваний.
Перечисленные выше методы в силу своей относительно невысокой чувствительности позволяют выявлять только высокие концентрации антител. Чувствительность методов, основанных на связывании антигенов и антител, существенно повышается при связывании последних с различными метками (табл. 16.5). Как видно из приведенных в таблице данных, существенному повышению чувствительности и качества серологических методов способствует использование изотопных или ферментных меток. Различные модификации этих методов в настоящее время нашли наиболее широкое применение для диагностики инфекционных заболеваний.
Применение радиоизотопной метки возможно при условии, что антитела или антигены, меченные 131I, 125I или 3Н и 14С, сохраняют способность участвовать в иммунологических реакциях. Как жидкофазная, так и твердофазная техника радиоиммунного определения
Таблица 16.5. Чувствительность методов выявления антител
Реакция |
Выявляемые количества антител (миллиграммы азота антител в 1 мл) |
Преципитация в растворе |
3-5 |
Преципитация в геле |
2-18 |
Агглютинация бактерий |
0,02-20 |
Связывание комплемента |
0,1 |
Агглютинация пассивная |
0,005 |
Радиоиммуноанализ |
0,0000001 |
Иммуноферментный анализ |
0,000001-0,00000001 |
антигенов или антител не нашли широкого применения в диагностике инфекционных заболеваний и применяются в основном для определения белков и препаратов, присутствующих в биологических жидкостях организма в "следовых" концентрациях (гормоны, медикаменты, ферменты, нуклеотиды, компоненты комплемента, мембранные рецепторы лимфоцитов).
Наряду с радиоиммунной техникой в арсенал иммунологических методов была включена ферментная метка. Для этого метода способ отделения меченого связанного реагента от несвязанного имеет решающее значение, что стало возможным с применением иммуносорбентной техники, которая получила название иммуноферментный анализ – ИФА. Чувствительность метода позволяет определять минимальные концентрации (на-нограммы) вещества.
Известно много вариантов ИФА, среди которых различают гомогенный и гетерогенный варианты. В основе гомогенного ИФА, применяемого для определения низкомолекулярных субстанций (гаптены), лежит ингибирование активности фермента, использованного в качестве метки при его соединении с гаптеном (активность фермента восстанавливается в результате реакции антигена с антителом), либо, наоборот, потеря активности маркерного фермента в результате реакции антиген-антитело. В связи с этим удаление свободного антигена (АГ) из смеси, содержащей АГ в связанном виде, в составе иммунных комплексов невозможно.
В противоположность этому при гетерогенном ИФА АГ или антитела (АТ) фиксируются на твердой фазе (как правило, это пластик), а непрореагировавшие компоненты реакции удаляются многократным отмыванием после каждого этапа постановки метода. В зависимости от использованного для метки фермента применяются разные субстратные смеси – индикаторы реакции. Учет реакции осуществляется спектрофотомет-рически.
Практическое значение имеют следующие варианты ИФА:
- непрямой тест,
- техника "двойных" антител (сэндвич-метод),
- "конкурентный" тест с использованием меченых антигенов и антител.
Перечень ферментов, наиболее часто используемых для мечения специфических антител, и индикаторов для визуализации реакции представлены в табл. 16.6.
Таблица 16.6. Ферменты-маркеры, наиболее часто используемые в ИФА
Фермент |
Индикатор реакции |
Реагент для остановки реакции |
Длина волны для оценки реакции |
Пероксидаза |
Н2O2 ортодианизидин или ортофенилендиамин; 2,2-азино-диэтилбензтиа-золинсульфат (АБТС) |
НС1 5М H2SO4 2М NaOH 1М |
535 405 405 |
Щелочная фосфатаза |
Паранитрофенилфосфат |
NaOH 1М |
402 |
Глюкозооксидаза |
Н2O2 (пероксидаза)о-диа-низидин или АБТС |
H2SO4 0,5М |
405 |
D-β-галактозидаза |
Паранитрофенил-β-D-галактозид |
H2SO4 0,5М |
366 |
Особенности постановки различных вариантов ИФА заключаются в стандартизации используемых антигенов и антител и тщательном отмывании от непрореагировавших реагентов на всех этапах реакции. Для выявления антител к бактериальным антигенам чаще всего используют непрямой ИФА (рис. 16.3, А). Для этого фиксированный на носителе бактериальный антиген инкубируют с исследуемой сывороткой крови пациента.
При наличии в сыворотке крови соответствующих антител они связываются с антигеном, а образующийся комплекс антиген–антитело выявляется с помощью меченных ферментом антител против иммуноглобулинов человека (конъюгат). Ферментативная активность метки регистрируется по степени разложения субстрата, изменение окраски которого находится в прямой зависимости от количества антител, содержащихся в исследуемой сыворотке.
Если в состав конъюгата входят антитела против IgG человека, то в исследуемой сыворотке определяются только антитела, относящиеся к этому классу иммуноглобулинов. Если же в состав конъюгата входят антитела против IgM человека, то выявляются только антитела, состоящие из иммуноглобулинов этого класса, специфичные сорбированному антигену. Чем больше антител содержится в сыворотке, тем более интенсивно окрашивается субстратная смесь.
Рис. 16.3. Методы ИФА для определения бактериальных антигенов и антител.
А – непрямой ИФА; Б – сэндвич-метод ИФА; В – конкурентный метод (торможение).
П – твердая фаза (носитель); пунктиром обозначена стадия сорбции антигенами меченных ферментом антибактериальных антител, содержащихся в исследуемой сыворотке.
Для выявления антигенов используются как сэндвич-метод, так и варианты конкурентных реакций. Принципы вариантов ИФА представлены на рис. 16.3.
Техника двойных антител (сэндвич-метод) подразумевает применение специфических антител против одного или нескольких бактериальных поливалентных антигенов. При этом используют моноклональные антитела или комплекс сывороточных иммуноглобулинов, которые фиксируют на твердом носителе (твердая фаза) и метят ферментом (конъюгат). Исследуемый образец сыворотки инкубируют с твердой фазой для образования комплекса антиген–антитело. Образовавшийся комплекс антител с поливалентным антигеном после стадии многократного отмывания инкубируют с конъюгатом (см. рис. 16.3, Б), а затем с соответствующим метке субстратом. Интенсивность окраски субстратной смеси находится в прямой зависимости от содержания антигена в исследуемом образце сыворотки. Возможен как визуальный, так и инструментальный учет результатов с помощью спектрофотометра.
Выявление бактериальных антигенов в сыворотке крови возможно с помощью торможения реакции взаимодействия фиксированного на носителе антигена с соответствующими меченными ферментом антителами. Этот вариант ИФА предполагает введение дополнительной стадии, которая включает взаимодействие меченых антител (конъюгата) с антигенами, содержащимися в исследуемой сыворотке (см. рис. 16.3, В). При наличии в сыворотке крови антигенов, например синегнойной палочки, они связываются с соответствующими антителами антисинегнойного конъюгата полностью или частично. Поэтому при последующем взаимодействии с фиксированным на полистироле антигеном лишь свободные антитела конъюгата способны связываться с ним. При этом интенсивность окраски субстратной смеси будет меньше, чем при отсутствии антигенов синегнойной палочки в исследуемой сыворотке, т.е. в данном случае зависимость между интенсивностью окраски субстратной смеси и количеством антигена в исследуемом образце обратно пропорциональная.
Иммуноферментный анализ чаще всего проводится в микроплатах с плоским дном, что позволяет проводить как качественный, так и количественный учет результатов реакции на вертикальных спектрофотометрах. Для определения количества антигена готовят двукратные разведения стандартного антигена в пуле донорских сывороток (референс-положительные образцы) и проводят с ними реакцию торможения ИФА одновременно с исследуемыми образцами сыворотки пациентов. На основании оптической плотности образцов в лунках, соответствующих разным разведениями референс-положительных образцов, строят калибровочную кривую (рис. 16.4).
Величину экстинкции в исследуемом образце сыворотки проецируют на калибровочную кривую. Для определения концентрации антигена в образце от точки пересечения опускают перпендикуляр на ось абсцисс.
В последнее время по экономическим соображениям стали отказываться от метода ИФА на микротитровальных планшетах. Примером может служить новый и более удобный для потребителя набор Immunocomb System, основанный на непрямом методе ИФА, разработанный и выпускаемый фирмой "Оrgenics" (Израиль). В нем используется пластиковая гребенка с зубцами, на которых адсорбирован антиген. Пробу добавляют в соответствующие лунки специальной кассеты, куда вставляют зубцы гребенки. После первичной инкубации гребенку переносят в промывающее устройство и затем в раствор, содержащий конъюгат антииммуноглобулинов с ферментом. После повторной промывки гребенку переносят в раствор субстрата, образующего нерастворимый окрашенный продукт. Такая последовательность позволяет одновременно проводить анализ и получать калибровочную кривую.
Рис. 16.4. Калибровочная кривая для спектрофотометрического учета результатов ИФА.
Другим примером усовершенствования набора может служить использование полимерной палочки с иммобилизованными антителами, так называемого гамма-стика. Гамма-стик входит в набор Coli-Test 99 EIA, который разработала и выпускает фирма Molecular Genetics Inc для обнаружения Е. coli. Конструкция гамма-стика позволяет увеличивать количество антител, которые можно иммобилизовать на твердой фазе, и отношение площади поверхности реагентов к объему реакционной смеси, тем самым ускорив анализ. Такой вариант идеален для проведения единичных проб. Напротив, микротитро-вальные планшеты идеально подходят для выполнения большого числа анализов.
В настоящее время стандартные наборы для диагностики инфекционных заболеваний на основе ИФА сопровождаются подробной инструкцией по выполнению всех этапов выявления антител или антигенов, что исключает необходимость подробного описания техники исследования. Принцип выполнения любого варианта ИФА состоит в последовательном внесении в лунки с фиксированными антителами или антигеном исследуемых сывороток и инкубации для образования комплекса антиген–антитело и отмывания от непрореагировавших компонентов. Затем вносятся меченные ферментом антитела к исследуемому антигену или иммуноглобулину, входящему в состав образовавшегося комплекса, и после повторной инкубации проводится второй цикл отмывания и внесение субстратной смеси для визуализации продуктов реакции. В силу высокой чувствительности метода основные требования при проведении ИФА предъявляются к дозаторам, которые должны обеспечивать взятие точного объема сыворотки или другого материала, и к этапам отмывания непрореагировавших продуктов. Поэтому при невозможности проведения анализа в автоматическом режиме внесение проб и реагентов необходимо осуществлять с помощью автоматических пипеток-дозаторов, регулярно проверяемых метрологической службой, а промывать лунки с помощью специального прибора – "вошера" или многократно с помощью многоканальной пипетки, тщательно вытряхивая содержимое лунок после внесения отмывающего раствора.
16.2.2.2. Техника определения концентрации иммуноглобулинов
Количественное определение неспецифических иммуноглобулинов в сыворотке крови и биологических жидкостях характеризует функциональную активность В-лимфоцитов. В качестве основных методов определения иммуноглобулинов классов А, М и G эксперты ВОЗ рекомендуют радиальную имму-нодиффузию (РИД) по Манчини и нефелометрию.
Для определения иммуноглобулинов методом РИД выпускают наборы моноспецифических антисывороток против иммуноглобулинов отдельных классов и стандартов (сывороток с известным содержанием иммуноглобулинов).
Реакцию проводят на стекле от фотопластинок (эмульсию удаляют кипячением в растворе стирального порошка) размером 10x12 см, которые покрывают равномерным слоем 1,5 % агара, содержащего специфичную для конкретного иммуноглобулина антисыворотку. Толщина слоя агара 1–1,1 мм.
Внесение в жидкий 1,5 % агар антисыворотки проводят на водяной бане при температуре 55–56°С. Объем агара для получения оптимального слоя на фотопластине равен 10 мл. Этот объем помещается в пробирку, которую выдерживают в водяной бане до выравнивания температуры (около 7 мин), после чего в него вносят расчетный объем антисыворотки в соответствии с ее паспортными титрами. При титре коммерческой антисыворотки к IgG в РИД 1:16 объем раствора антисыворотки, который должен содержаться в 10 мл рабочей концентрации агара, – 10 : 16 = 0,63 мл, т.е. этот объем антисыворотки надо смешать с 9,37 мл 1,5% агара. В такой же последовательности готовится агар для определения IgA и IgM.
Для получения раствора антисыворотки в ампулу с высушенной антисывороткой вносят 1 мл воды; полное растворение без помешивания должно произойти не более чем за 1 ч. В противном случае эта сыворотка не используется.
Стекло с застывшим агаром кладут на трафарет – план расположения лунок. В этих местах агар продавливают трубкой-пробойником с тонкой стенкой и внутренним диаметром 2– 2,5 мм, агар отсасывают водоструйным насосом. В лунки вносят образцы сывороток и четыре разведения стандарта – в 2, 4, 8 и 16 раз. Стекла инкубируют во влажной камере при комнатной температуре 18–20 ч.
Метод основан на формировании в агаре с антисывороткой, преципитата вокруг лунки, в которую вносят объект исследования (сыворотку крови или другую биологическую жидкость организма), содержащий иммуноглобулин. Размер кольца преципитации зависит от концентрации антигена (иммуноглобулина).
Учет результатов: измеряют диаметры колец вокруг каждой лунки. Расчет концентрации проводится по калибровочной Кривой, которую строят на полулогарифмической бумаге. Для этого по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципитации проб стандарта, а по оси ординат – количество иммуноглобулина в данном разведении стандарта (в мг%, МЕ, г/л). Из точки абсциссы, соответствующей каждому диаметру кольца, восстанавливают перпендикуляры до пересечения с уровнем, соответствующим количеству иммуноглобулина в данном разведении стандарта. Точки пересечения соединяют между собой, получая графическое изображение зависимости концентрации иммуноглобулина и диаметра кольца преципитации.
Для определения концентрации иммуноглобулина в исследуемом образце на оси абсцисс отмечают диаметр кольца преципитации испытуемой сыворотки, восстанавливают перпендикуляр до пересечения с калибровочной кривой, точку пересечения проецируют на ось ординат. Полученное значение соответствует концентрации иммуноглобулина.
16.2.2.3. Техника проведения реакции пассивной гемагглютинации для определения противобактериальных антител
В настоящее время определение антител к антигенам золотистого стафилококка, протеев, клебсиелл, синегнойной и кишечной палочек, стрептококка, пневмококка проводится с помощью стандартных эритроцитарных диагностикумов.
Для разведения диагностикума и сывороток используют изотонический раствор хлорида натрия с формалином. Для получения нужной концентрации вносят 40 % раствор формалина в 0,9 % раствор №С1 в соотношении 1 : 100. Хранят в холодильнике.
Подготовка сывороток: перед ^проведением исследования все сыворотки прогревают при 56 °С в течение 30 мин.
Подготовка диагностикумов: рабочее разведение получают, смешивая 1 мл диагностикума и 5 мл изотонического раствора хлорида натрия с 1 % формалина. Необходимое количество диагностикума рассчитывается в зависимости от количества исследуемых сывороток и занятых лунок. Например, при исследовании 5 сывороток будет задействовано 12 лунок, в каждую из которых надо внести по 30 мкл разведенного диагнос-тикума, т.е. 1,8 мл. Для этого смешать 300 мкл (0,3 мл) концентрированного диагностикума и 1500 мкл (1,5 мл) изотонического раствора хлорида натрия с 1 % формалина.
Постановка РПГА микрометодом: в первые лунки горизонтальных рядов 96-луночного планшета внести по 90 мкл (0,09 мл) изотонического раствора хлорида натрия с формалином, в остальные – по 50 мкл (0,05 мл). В первые лунки внести по 10 мкл (0,01 мл) прогретых исследуемых сывороток. Двукратные разведения удобно готовить с помощью 8-канальной пипетки, перенося в последующие лунки по 50 мкл (0,05 мл). Последние лунки остаются свободными от сыворотки – контроль диагностикума. Во все лунки внести по 30 мкл диагностикума в рабочем разведении.
Учет реакции проводится на следующий день после инкубации при комнатной температуре. Титром считается разведение в последней лунке, где есть агглютинация эритроцитов (осадок в виде колечка с неровными краями). При этом в контрольных лунках должен образоваться плотный ровный осадок – "пуговка".
Полученные разведения сыворотки соответствуют титрам: 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/640, 1/1280, 1/2560, 1/5120, 1/10240.
У здоровых людей уровень антител к антигенам условно-патогенной микрофлоры в сыворотке крови колеблется в диапазоне, соответствующем титрам от 0 до 1:80. Исключение составляют антитела к золотистому стафилококку (до 1:320), носительство которого встречается наиболее часто.
16.2.2.4. Микрометод определения активности компонентов комплемента
Постановка реакции. Во все лунки 6 вертикальных рядов 96-луночной панели (А–Н) вносят по 25 мкл (0,025 мл) рабочего раствора буфера РРБ (приготовление описано в разделе 16.4). В первую лунку каждого ряда вносят по 25 мкл исследуемой сыворотки, делают двукратные разведения (в ряду А– Н). В результате получают:
- в лунке А разведение 1:2,
- в лунке В – 1:4,
- в лунке С – 1:8,
- в лунке D – 1:16,
- в лунке Е – 1:32,
- в лунке F – 1:64,
- в лунке G – 1:128,
- в лунке Н – 1:256.
Во все лунки одного вертикального ряда от А до Н вносят по 5 мкл соответствующего реагента: С1 – в ряд N° 1; С2 – в ряд № 2; С3– в ряд № 3 и т.д.
В лунки ряда № 6 (определение общей активности комплемента) вносят по 5 мкл РРБ. После этого во все лунки всех 6 рядов вносят по 20 мкл ЕА-комплекса, т.е. сенсибилизированных эритроцитов в концентрации 109 кл/мл.
Инкубация продолжается 1 ч при 37°С, затем – не менее 30 мин в холодильнике для полного оседания эритроцитов. Результаты оценивают визуально по последней лунке, где произошел полный гемолиз. Нормальные показатели: для общей активности – 1:16 – 1:64 (гемолиз в лунках D – F).
Для компонентов комплемента – 1:32 – 1:128 (гемолиз в лунках Е – G).
При недостаточности какого-либо компонента комплемента отмечается снижение общей комплементарной активности.
16.2.3. Оценка интерферонового статуса
По значимости система интерферонов приближается к системе иммунитета, а по универсальности даже превосходит ее, что послужило основанием для предложения интегрального понятия "интерфероновый статус" (ИФ-статус). В это понятие входят параметры, определяющие состояние интерферонов (ИФ): содержание различных видов ИФ в циркулирующей крови, способность лейкоцитов вырабатывать ИФ-α и ИФ-γ при соответствующей индукции in vitro и ряд других показателей, из которых некоторые еще разрабатываются. Способность лейкоцитов продуцировать ИФ-α при строго стандартизованных условиях вирусной индукции называется интерфероновой реакцией лейкоцитов (ИРЛ) и используется как показатель неспецифической реактивности организма.
Наиболее простым и доступным суммарным показателем служит количественное определение интерферона (ИФ) в сыворотке крови (сывороточный, или циркулирующий, ИФ). Другими показателями ИФ-статуса служат определение уровня продукции ИФ-α и ИФ-γ лейкоцитами, индуцированными in vitro.
В норме ИФ-статус характеризуется, как правило, низкими концентрациями ИФ в сыворотке крови и выраженной способностью лейкоцитов продуцировать этот полипептид в ответ на адекватную индукцию. У 90 % здоровых людей уровень ИФ не превышает 4 МЕ/мл. В ответ на индукцию у 80 % здоровых лиц уровень ИФ-α и ИФ-γ колеблется между 64 и 1280 МЕ/мл.
Индивидуальный уровень ИФ в здоровом организме генетически детерминирован, и поэтому способность продуцировать ИФ широко варьирует. Диапазон колебаний титров ИФ-α у здоровых людей зарегистрирован в пределах 1–2500 МЕ/мл в зависимости от использованного индуктора. Заметно угнетают выработку ИФ охлаждение, понижение, питания, ионизирующее излучение, действие иммунодепрессантов, стероидных гормонов. Повышение температуры тела на высоте заболевания сопровождается увеличением уровня циркулирующего ИФ.
При патологии нарушения интерфероногенеза могут быть первичными и вторичными (приобретенными). Острые вирусные инфекции в большинстве случаев сопровождаются повышением уровня ИФ в первые часы заболевания. Параллельно происходит активация ИФ-зависимых внутриклеточных противовирусных механизмов и иммунных реакций. Отсроченная и сниженная продукция эндогенного ИФ может вести к хронизации заболевания или злокачественному прогрессированию вирусной инфекции.
Иммунный ИФ является лимфокином с выраженными иммуномодулирующими свойствами и способностью угнетать пролиферацию клеток. При нормальном функционировании систем иммунитета и интерферона существует равновесие между функциональной активностью лимфоцитов, выраженной их пролиферативной активностью, и продукцией ИФ. В табл. 16.7 представлены варианты изменения ИФ-статуса в норме и при некоторых видах патологии.
Таблица 16.7. Интерфероновый статус в норме и при патологии
Группы обследованных |
Возможные варианты ИФ-статуса |
Характер изменений ИФ-статуса |
||
сывороточный |
α |
γ |
||
Здоровые люди |
N |
N |
N |
Все показатели в пределах нормы (контроль) |
Стрессы, острые вирусные инфекции, аллергические заболевания |
↑ |
↓ |
↓ |
Разная степень повышения сывороточного ИФ в сочетании с подавлением α- и γ-звена |
Хронические вирусные инфекции (герпес, гепатит, рассеянный склероз и т.д.) |
N |
↓ |
↓ |
Глубокое подавление всех показателей |
Аутоиммунные болезни (СКВ, ревматоидный артрит и т.д.) |
N или ↑ |
↓ |
N |
Подавление α-звена |
Острый лимфолейкоз, опухоли, проказа |
N или ↑ |
N |
↓ |
Подавление γ-звена |
Показаниями к исследованию ИФ-статуса являются острые и хронические вирусные инфекции, аллергические и аутоиммунные заболевания, рецидивирующие оппортунистические инфекции, врожденные и приобретенные дефекты системы ИФ, клинические испытания препаратов ИФ, индукторов ИФ и иммуномодуляторов.
Реакция ИФ-статуса может быть осуществлена макро- или микрометодом. Различия касаются только объемов вносимых реагентов.
1-я ступень – количественная, позволяет определить количественные параметры физиологического или патологического ИФ ответа in vitro и ex vivo и включает определение:
- количества циркулирующего в крови ИФ;
- уровня продукции ИФ-α лейкоцитами при его индукции вирусными индукторами in vitro;
- уровня продукции ИФ-γ при его индукции митогенами in vitro;
- уровня продукции спонтанного ИФ (дополнительный тест).
2-я ступень определения ИФ-статуса – качественная, включает характеристику некоторых показателей 1-й ступени и требует постановки дополнительных тестов для определения:
- типа (класса) циркулирующего ИФ;
- кислоте-лабильности циркулирующего ИФ;
- кислотолабильности индуцированного in vitro ИФ-α;
- типа спонтанно продуцируемого in vitro ИФ;
- кислотолабильности спонтанного ИФ.
Совокупность тестов 1-й и 2-й ступеней позволяет выявить ИФ-избыточное и ИФ-дефицитное состояние, глубину дефектов ИФ-системы при различных патологических состояниях.
Постановка тестов 1-й ступени должна проводиться в день забора крови.
16.2.3.1. Техника определения ИФ-статуса
Тесты 1-й ступени. Кровь в объеме 0,5–1,0 мл помещают в стерильную центрифужную или пластмассовую одноразовую пробирку, содержащую 10–20 ЕД гепарина. Для правильной оценки результатов одновременно подсчитывают лейкоциты в 1 мкл крови (в камере Горяева) или выписывают этот показатель из общего анализа крови, выполненного в день исследования или накануне.
Макрометод (в объеме 1 мл). В три центрифужные пробирки вносят по 800 мкл среды RPMI-1640 с глутамином (0,3 мг/мл) и гентамицином (0,08 мг/мл), 100 мкл цельной гепаринизиро-ванной крови и 100 мкл вируса болезни Ньюкасл (ВБН), фитогемагглютинин (ФГА) и среды RPMI-1640 для индукции ИФ-α, ИФ-γ и спонтанного соответственно. Конечное разведение крови 1:10, концентрация ВБН – 1 ЦПЕ/мл, концентрация ФГА – 5 мкг/мл. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и помещают в термостат при 37°С на 24 ч. Общий расход крови 300 мкл. Оставшуюся кровь центрифугируют для получения сывороточного ИФ.
После инкубации опытных пробирок, не взбалтывая, отбирают пробы и переносят в стерильные флаконы. В пробу с ВБН вносят 1 N НС1 до рН 2,0 для инактивации вируса, которую проводят 72 ч при 4°С. Перед титрованием в пробу с инактивированным ВБН вносят 1 N NaOH до рН 7,0. При необходимости хранения проб их можно замораживать при –70 °С.
Микрометод (в объеме 200 мкл). Тесты 1-й ступени определения ИФ-статуса ставятся в стерильных 96-луночных круглодонных планшетах в трех повторах (9 лунок на каждую пробу). В каждую лунку, содержащую 160 мкл среды RPMI-1640 (с глутамином и антибиотиками), вносят: в первые три – по 20 мкл ВБН; во вторые три – по 20 мкл ФГА; в третьи – по 20 мкл среды RPMI-1640 и во все 9 лунок – по 20 мкл цельной крови. Содержимое лунок перемешивают, планшеты закрывают крышкой и инкубируют при 37 °С 24 ч в атмосфере 5 % СО2. Общий расход крови на одно тестирование – 180 мкл. Оставшуюся кровь центрифугируют для получения сывороточного ИФ при 800–1000 об./мин 10–15 мин.
Определение активности ИФ. Титрование ИФ проводят в 96-луночных плоскодонных планшетах с диплоидной культурой фибробластов человека М19 в среде Игла с 10 % бычьей сыворотки (105 кл/мл). Культуру в объеме 200 мкл на 1 лунку выращивают 24–48 ч (до образования сплошного монослоя) при 37 °С в атмосфере 3 % СО2.
В качестве тест-вируса используют вирус везикулярного стоматита (ВВС, штат Индиана). За единицу активности ИФ принимают величину, обратную его разведению, задерживающую деструкцию монослоя на 50 % (МЕ/мл). В каждое титрование берут пробу референс-ИФ с известной активностью, выраженной в ME на мл.
Пересчет ед/мл в МЕ/мл проводится по формуле:
где Ао – активность исследуемого образца ИФ, МЕ; Ар – активность референс-ИФ, МЕ; Т0 – титр исследуемого образца ИФ в опыте, ЕД/мл; Тр – титр референс-ИФ в опыте, ЕД/мл.
При некоторых патологических состояниях количество лейкоцитов крови значительно увеличивается (или снижается), что при сохранении или снижении интерферониндуцирующей способности лейкоцитов может создать искаженное представление о повышенной или нормальной функциональной активности а- и у-звеньев системы ИФ. Поэтому для правильной оценки показателей ИФ-статуса рекомендуется производить пересчет единиц активности ИФ в мл, определенных по тестам 1-й ступени, в единицы активности на 1000 лейкоцитов. Тогда физиологические значения продукции ИФ-α и ИФ-γ будут иметь следующие средние значения:
ИФ-α - 0,7 - 1,4 МЕ/тыс. (1),
ИФ-γ - 0,14 - 0,28 МЕ/тыс. (2),
где (1) и (2) – частное от деления единиц активности ИФ-α и -γ в 1 мл 10-кратно разведенной крови на число лейкоцитов в нем (т.е. в 100 мкл цельной крови) при максимальной норме 9-103 мкл.
Тесты 2-й ступени. Определение типа сывороточного и спонтанно индуцированного ИФ. Тест проводится с помощью антисывороток против ИФ-α и ИФ-γ. Выбор единиц активности антисыворотки зависит от титров сывороточного или спонтанного ИФ, определенного по тестам 1-й ступени. Антисыворотка в рабочем разведении должна иметь активность, нейтрализующую 50–100 МЕ/мл референс-ИФ человека соответствующего типа. При необходимости предварительно осуществляется титрование антисыворотки.
В 3 пробирки, содержащие по 200–250 мкл референс-ИФ человека, проб сывороточного и спонтанного ИФ, вносят равное количество (200–250 мкл) антисыворотки, нейтрализующей 50–100 МЕ/мл референс-ИФ-α. Смесь перемешивают и выдерживают в течение 1 ч при 37 °С или 24 ч при 4 °С.
На монослой диплоидной культуры М19, выращенный в плоскодонных 96-луночных планшетах, после удаления культуральной жидкости вносят по 100 мкл каждой из исследуемых смесей проб и референс-ИФ-α (после контакта с антисывороткой). Каждую пробу вносят в 3 лунки (3 повтора). Параллельно в 3 повторах ставят контроли: контроль пробы, контроль вируса и контроль клеток.
Планшеты инкубируют 24 ч при 37°С в атмосфере 3–5 % СО2. После инкубации из лунок удаляют пробы, монослой отмывают средой Игла и заражают (кроме контроля клеток и контроля антисыворотки) тест-вирусом ВВС в дозе, вызывающей его 100 % деструкцию. Вирус инкубируют в течение 24 ч при 37°С в атмосфере 3 % С02. Полная задержка цитопати-ческого действия вируса в контролях проб и референс-контролях и 100 % деструкция монослоя в опытных и референс-пробах с антисывороткой однозначно указывают на принадлежность исследованного ИФ к ИФ-α. Два контроля антисыворотки вводят для выявления токсического действия антисыворотки на культуру (без вируса) и исключения возможности задержки цитопатического действия вируса антисывороткой (с вирусом).
Титрование на принадлежность к ИФ-β и ИФ-γ проводится аналогичным образом.
Определение кислотолабильности сывороточного и спонтанного ИФ. Пробы сывороточного и спонтанного ИФ обрабатывают 1 N НС1 (рН 2,0) в течение 24 ч при 4°С. По окончании инкубации рН проб доводят до 7,0 1 N NaOH. В контролях используют эквивалентное количество фосфатного буфера. Пробы титруют в диплоидной культуре М19 для определения активности ИФ, как это было описано выше.
Наличие защитного действия ИФ в разведениях контрольных проб и полное его отсутствие в опытных пробах указывают на кислотостабильность сывороточного или спонтанного ИФ. Тестирование ИФ-α и его кислотолабильности свидетельствуют об аномальности сывороточного (или спонтанного) ИФ.
Определение кислотолабильности ИФ-α. Для выявления кислотолабильности ИФ-α, индуцированного in vitro, его индукцию проводят с помощью полиинозина–поли(И), полицитозина–поли(Ц). В 6 лунок вносят по 160 мкл среды RPMI-1640, содержащей, кроме глутамата и гентамицина, ДЭАЭ-декстран в концентрации 250 мкг/мл. В лунки добавляют по 20 мкл поли(И) и поли(Ц) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл. Во все лунки вносят по 20 мкл цельной крови. Содержимое перемешивают. Планшеты инкубируют при 37 °С 24 ч в атмосфере 5 % СO2. После инкубации отбирают пробу ИФ-α, которую разделяют на две части. Одну часть пробы ИФ-α обрабатывают 1 N НС1 до рН 2,0 в течение 24 ч при 4 °С. Перед титрованием рН этой пробы доводят до 7,0 с помощью 1 N NaOH. После титрования обеих проб (обработанной и необработанной) сравнивают активность ИФ-α.
Наличие активности ИФ в необработанной части пробы и его полное отсутствие в обработанной части указывают на кислотолабильность ИФ-α.
Этот тест проводят при низкой продукции ИФ-α или полном его отсутствии при индукции с помощью ВБН по тестам 1-й ступени определения ИФ-статуса.
Преимущество этой методики оценки ИФ-статуса состоит в использовании малых объемов крови, простоте, легкости выполнения. Выделения лейкоцитов или лимфоцитов не требуется. Индукция ИФ в цельной крови наиболее приближена к условиям in vivo.
[1] Приготовление красителя: 1 г метилового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют и хранят в холодильнике. Недостаточно очищенный краситель имеет фиолетовый цвет, от которого можно избавиться, экстрагируя примеси хлороформом. Для этого смешать водный раствор красителя с равным объемом хлороформа и после расслоения аккуратно слить водную часть. Повторить 2—3 раза до получения чистого зеленого цвета красителя. Процедуру проводить в вытяжном шкафу.