Ложноположительные и ложноотрицательные результаты ПЦР – серьезная и часто недооцениваемая проблема, являющаяся оборотной стороной исключительно высокой чувствительности метода.
Причинами ложноположительных результатов являются следующие три вида контаминации:
- перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе раскапывания реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов;
- контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими клонированные последовательности детектируемого гена и использующимися в качестве положительного контроля;
- контаминация продуктами амплификации (ампликонами), являющаяся наиболее частой причиной ложноположительных результатов, поскольку в процессе ПЦР-генодиагностики ампликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы.
Первые две формы контаминации легко устраняются при соблюдении известных мер предосторожности. В целях исключения ложноположительных результатов подготовку исследуемого материала, проведение ПЦР и анализ результатов амплификации необходимо проводить в отдельных помещениях. Реакционная смесь ПЦР должна храниться в стерильной посуде при –20 °С. Для работы используются только стерильные одноразовые пробирки и наконечники для пипеток. Необходимо проводить регулярную обработку рабочих мест ультрафиолетовыми лучами и 0,3% раствором HCl.
На каждом этапе работы (выделение ДНК, проведение амплификации, электрофоретический анализ полученных результатов) необходимо использовать собственные лабораторные контроли и периодически применять зашифрованные отрицательные и положительные контрольные образцы для оценки специфичности и чувствительности ПЦР-генодиагностических исследований. При каждой постановке ПЦР рекомендуется применять отрицательные контроли: на процедуру экстракции, буферный раствор, праймеры (пробирки, не содержащие ДНК-матрицы) ("Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции", ГКСЭН РФ, утверждены 22 июня 1995 г.).
Наиболее серьезную проблему для преодоления представляет контаминация ампликоном. В настоящее время существует несколько методов инактивации продуктов ПЦР. Различают предамплификационную и послеамплификационную инактивацию. Метод инактивации продуктов ПЦР предамплифика-ционным облучением основан на известной способности коротких волн УФ-света вызывать образование димеров тимиди-на и другие ковалентные модификации в молекулах ДНК. Основными преимуществами метода являются простота выполнения и отсутствие затрат. Эффективность инактивации ультрафиолетовым облучением находится в зависимости от длины и нуклеотидного состава ДНК-мишени. Установлено, что короткие ампликоны (менее 300 пар оснований) инактивируются не полностью.
К послеамплификационной инактивации ампликонов относятся фотохимические и химические методы. С целью проведения фотохимической инактивации в реакционную ПЦР-смесь до начала амплификации вносят фурокумарины (псора-лен или изопсорален), устойчивые к температурным условиям ПЦР. После завершения амплификации перед детекцией продуктов ПЦР фотохимический реагент активируют облучением длинными волнами (300–400 нм) ультрафиолетового света. Возбужденные ультрафиолетовыми лучами фурокумарины ко -валентно связываются с нуклеиновыми кислотами, интерка-лируя между ними. Образующиеся фурокумарин-пиримиди-новые комплексы блокируют удлинение праймеров Тaq-полимеразой.
Одним из вариантов химической инактивации продуктов ПЦР является гидролиз праймеров. В этом случае используют праймеры, содержащие на конце 3' одно рибозное звено или более. В результате образуются ампликоны, содержащие фос-фатилированную рибозу, чувствительную к щелочному гидролизу. При добавлении NaОН к продукту ПЦР происходит удаление рибозных остатков праймеров из ампликонов. Модифицированные таким образом ампликоны не могут служить эффективными мишенями при проведении последующих амплификации.
Другой вариант химической инактивации продуктов ПЦР основан на способности гидроксиламина вызывать ковалентные модификации ДНК. Гидроксиламин избирательно реагирует с атомами кислорода в остатках цитозина, образуя ковалентные связи, что предохраняет от формирования пар с остатками гуанидина. Тем самым происходит модификация сайтов праймеров на последовательности мишени. Показано, что данный метод особенно эффективен для инактивации коротких ампликонов с высоким содержанием GС-пар.
Метод энзиматической инактивации продуктов ПЦР основан на функции фермента урацил-N-глюкозидазы удалять остатки урацила, образуя спонтанную деаминацию цитозина в двунитевой ДНК. При проведении амплификации один из дезоксинуклеотидтрифосфатов дТТФ заменяется дУТФ, который также служит субстратом для Тaq-полимеразы. В результате происходит накопление ампликонов, содержащих остатки дезоксиурацила. Урацил-N-глюкозидаза, вносимая в реакционную смесь до амплификации, удаляет остатки урацила в ампликонах-контаминантах. Происходит образование сайтов, высокочувствительных к щелочному гидролизу при повышенных температурах. В связи с тем, что ПЦР обычно проводят в условиях слабощелочных рН и высоких температур, продукты амплификации, обработанные урацил-N-глюкозидазой, разрушаются. Подобно фотохимической инактивации эффективность энзиматической инактивации зависит от длины ампли-кона и содержания GС-пар. Установлено, что для коротких ампликонов с высоким содержанием GС-пар метод энзиматической инактивации эффективнее, чем ультрафиолетовое облучение или фотохимическая обработка.
Быстрая экстракция ДНК или РНК из различных материалов, анализирующихся методом ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения микробной стенки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу К. Для экстракции ДНК используют различные модификации двух основных методов. Первый представляет собой классическую процедуру фенольно-хлоро-формной экстракции, при которой достигается хорошая очистка ДНК, в первую очередь от ингибиторов Тая-полимеразы, но при этом неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией идентифицируемого агента. Второй способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, основан на использовании нуклеосорбентов. Подготовка материала с применением нуклеосорбента занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может гарантировать удаление возможных ингибиторов.
Практическое применение ПЦР для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний. Для организации ПЦР-лаборатории необходимо три (минимум два) несмежных помещения общей площадью не менее 25–30 м2. Персонал лаборатории комплектуется двумя врачами-лаборантами, имеющими опыт проведения биохимических, микробиологических и иммунобиологических исследований, и лаборантом со средним медицинским образованием. Из-за высокой чувствительности реакции необходимо территориально разделить различные стадии проведения анализа, проводя их в отдельных помещениях:
- помещение для пробоподготовки, где производится обработка клинических образцов и выделение ДНК;
- помещение для постановки реакции амплификации, где готовится реакционная смесь и непосредственно проводится реакция;
- • помещение для анализа результатов, где проводится детекция продуктов амплификации.
Работа должна производиться в лабораторной одежде, сменяемой при переходе из одного помещения в другое, и в одноразовых перчатках, так как анализируемые биопробы являются потенциально инфицированным материалом. Обработка одежды из разных помещений должна производиться раздельно. Желательно, чтобы на разных этапах проведения ПЦР-анализа работали различные сотрудники.
Следует использовать отдельные наборы полуавтоматических пипеток, предназначенные для различных стадий анализа и не переносимые из одного помещения в другое.
Все этапы работы необходимо проводить только с использованием одноразовых расходных материалов: наконечников для микропипеток, пробирок, перчаток и т.д. Обязательно менять наконечники при переходе от пробы к пробе, желательно использовать наконечники с фильтром – аэрозольным барьером для предотвращения попадания микрокапель раствора в пипетку. Использованные пробирки и наконечники должны сбрасываться в специальные контейнеры или емкости, содержащие дезинфицирующий раствор (1N соляная кислота, 10 % гипохлорит натрия или 10 % хлорная известь).
Клинические образцы следует хранить отдельно от реагентов.
Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует облучать ультрафиолетом с длиной волны (л) 260 нм. Облучение необходимо проводить в течение 1 ч после окончания работы.