Все существующие методы оценки антибиотикочувствительности микроорганизмов можно разделить на фенотипические и генотипические.
Генотипические методы основаны на прямой детекции генов, кодирующих детерминанты устойчивости к АБП. Генотипические методы детекции антибиотикорезистентности являются крайне перспективными, однако до настоящего времени их практическое применение ограничено. Для прямой детекции детерминант устойчивости используют ДНК–ДНК гибридизацию, амплификацию в полимеразной цепной реакции и некоторые другие методы.
Фенотипические методы предполагают оценку влияния АБП на жизнедеятельность микроорганизмов по таким параметрам, как скорость роста или биохимическая активность. Среди фенотипических методов хорошо стандартизованными являются методы серийных разведений и диффузионные, основанные на детекции роста исследуемых культур.
Методы серийных разведений позволяют непосредственным образом определять основной количественный показатель, характеризующий антибактериальную активность антибиотика, – величину минимальной подавляющей концентрации (МПК). Для определения величины МПК в посуду с питательной средой (пробирки, чашки Петри, лунки планшет и т.д.) вносят АБП в возрастающих концентрациях (обычно с двукратным шагом). Затем питательную среду засевают культурой исследуемого микроорганизма, после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста. Диапазон используемых концентраций АБП зависит от задач исследования (обычно от десятых долей мкг/мл до 100–200 мкг/мл). Длительность инкубации культур для большинства микроорганизмов составляет 18–20 ч (в ряде случаев длительность инкубации может быть увеличена).
Разновидностью метода серийных разведений является метод, основанный на использовании только двух концентраций АБП, соответствующих пороговым или пограничным (breakpoints). Эти концентрации отделяют "чувствительные" микроорганизмы от "промежуточных" и "промежуточные" от "резистентных". Метод обеспечивает получение качественных результатов, позволяющих отнести исследуемый микроорганизм к определенной категории чувствительности.
При использовании традиционного метода двукратных разведений МПК, фиксируемая экспериментатором, не соответствует истинной величине этого показателя. Истинная величина МПК будет находиться в промежутке между зафиксированной экспериментатором и концентрацией, в 2 раза ей уступающей и не вызвавшей ингибиции видимого роста. Так, при ингибиции роста микроорганизма в присутствии 2,0 мкг/мл АБП и наличии роста в присутствии 1,0 мкг/мл препарата точное значение МПК будет находиться в промежутке между этими величинами. При более высоких значениях фиксируемой экспериментатором МПК, например при 64,0 мкг/мл, истинное значение этой величины оказывается локализованным в еще более широком диапазоне: от 64,0 до 32,0 мкг/мл.
В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или бульоне.
В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро- и микроразведений. Благодаря возможности миниатюризации метод серийных разведений в бульоне является наиболее популярным и распространенным. На основе этого метода разработано и выпускается большое количество коммерческих тест-систем.
В классическом варианте метода серийных разведений наличие (появление мутности) или отсутствие роста регистрируют визуально. В коммерческих вариантах метода часто используют спектрофотометрическое измерение оптической плотности питательной среды. Поскольку для практических целей важно максимально сократить время исследования, разработаны методы детекции начальных стадий бактериального роста. Они основаны на внесении в инкубационную среду различных индикаторов (в том числе флюоресцентных), реагирующих на изменения pH.
Диффузионные методы. В настоящее время существуют два основных варианта диффузионного метода: диско-диффузионный и эпсилометрический (Е-тест). Исторически более старым и наиболее распространенным на практике является диско-диффузионный метод (Kirby–Bauer). Метод основан на формировании вокруг бумажного диска, пропитанного антибиотиком, зоны ингибиции поверхностного роста микроорганизма на плотной питательной среде.
При проведении исследования диск с АБП накладывают на поверхность плотной питательной среды, предварительно засеянной исследуемым микроорганизмом. Сразу же после нанесения диска на поверхность среды начинается процесс диффузии АБП из диска в среду. В это же время начинается процесс адаптации микроорганизма к питательной среде (лаг-фаза роста). Можно представить, что по поверхности среды от центра диска к периферии движется фронт концентрации АБП, способной подавить рост микроорганизма (рис. 10.3).
В самом общем виде следует лишь отметить, что рост микроорганизма (образование газона) начнется на тех участках поверхности среды, где к моменту окончания лаг-фазы концентрация АБП окажется ниже подавляющей. Таким образом, к окончанию периода инкубации на поверхности питательной среды сформируется сплошной газон культуры микроорганизма, а вокруг диска – круглая зона ингибиции роста.
Рис. 10.3. Закономерности диффузии антибиотика из дисков.
Интерпретация результатов оценки чувствительности с помощью диско-диффузионного метода предполагает использование пограничных значений диаметра зоны ингибиции роста. В результате экспериментального изучения большого количества штаммов можно получить зависимость между величиной МПК препарата и диаметром зоны ингибиции роста вокруг диска, далее, зная пограничные значения МПК, можно рассчитать пограничные значения диаметров зон ингибиции роста (рис. 10.4).
Для получения достоверной корреляции между значением МПК и диаметром зоны ингибиции роста очень важно подобрать оптимальное содержание АБП в диске.
В результате сопоставления пограничных и экспериментальных значений зоны ингибиции роста возможно отнесение микроорганизма к той или иной категории чувствительности.
Диско-диффузионный метод имеет определенные ограничения для некоторых комбинаций микроб – антибиотик. Например, для бета-лактамов и стрептококков группы "утоапв" не удается установить четкую зависимость между диаметром зоны ингибиции роста и величиной МПК препарата.
В эпсилометрическом методе в качестве носителя используется узкая полоска полимера (0,5 х 6,0 см), пропитанная различными концентрациями АБП (от минимальных до максимальных). Ингибиция роста микроорганизма вокруг полоски-носителя происходит только в той зоне, где концентрация антибиотика, диффундирующего из носителя, выше МПК. Результатом диффузии антибиотика в питательной среде является образование вокруг носителя каплевидной зоны ингибиции роста. Величины концентрации антибиотика в каждом участке носителя типографским способом нанесены на соответствующем отрезке наружной (обращенной к исследователю) поверхности носителя. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны ингибиции роста вплотную подходит к носителю. Детальные инструкции по проведению Е-теста прилагаются изготовителем к набору реактивов.
Рис. 10.4. Обоснование пограничных значений диаметров зон ингибиции роста микроорганизмов.