Типы порчи пищевых продуктов. Причины микробиологической порчи пищевых продуктов можно разделить на внутренние, внешние, технологические и неявные. Внутренние причины – это физико-химические и структурные характеристики собственно пи­щевого продукта (активность воды, значение pH, окислительно-восстановительный потенциал, содержание доступных микроорга­низмам питательных и нативных анти­микробиальных веществ). Внешними причинами называют условия хранения пищевого про­дукта (температуру, влажность и состав газовой среды, в которой он хранится). Технологическими причинами называют способы физико-химической обработки, нередко приводящие к изменению свойств пищевого продукта и соответственно его микробиоты. Неявные при­чины – это симбиотические, синергические и антагонистические взаимо­влияния микроорганизмов под воздействием указанных выше факторов.

Порча пищевых продуктов происходит в результате сложного комплексного процесса, при котором размножение конкретного микроорганизма, а значит, скорость порчи данного пищевого про­дукта зависят от типа продукта (внутренние причины), способа его упаковки и хранения (внешние причины).

Размножение микроорганизмов порчи и/или способность вызы­вать порчу продуктов зависят от взаимодействия микроорганизмов между собой. Например, конкуренто­спо­собность Pseudomonas ssp. повышается благодаря продуцированию сидерофоров, образу­ющих хелатные комплексы с железом; образованию субстратов для ре­акций порчи одним микроорганизмом с последующим использова­нием этих субстратов другим (так назы­ваемый метабиоз); «вклю­чению» реакций метаболизма, приводящих к порче, путем обмена информацией между клетками. Такая комплексность проблемы тре­бует рассмот­рения наряду с микроорганизмами, вызывающими порчу, собственно пищевых продуктов как среды для их деятель­ности.

Поведение микроорганизмов и его регулирование. Для предотвра­щения микробиологической порчи необходимо знать законы пове­дения микроорганизмов и их среду обитания. Следует знать микро­организмы как свойственные данному пищевому продукту, так и вызывающие его порчу. Например, на многих пищевых продуктах присутствуют плесени, которые почти никогда не приводят к их порче. И наоборот, присутствие грибов рода Alternaria требует осо­бого внимания, так как они продуцируют ряд довольно ядовитых микотоксинов. Однако их наличие (без размножения) в храня­щемся зерне и пивоваренном сырье может быть показателем их свежести, так как к тому времени, когда они погибнут, зерно уже частично утратит способность к прорастанию.

Практическое использование знаний о конкретных микроорга­низмах, вызывающих порчу, и пищевых продуктах, подверженных микробиологической порче, для регули­рования микробиологиче­ских параметров требует внедрения особых систем, технологий и методов. Наилучшую возможность контроля микробиологиче­ской порчи дает подход, основанный на НАССР (Hazard Analysis Critical Control Point) – оценке рисков и критических контрольных точек и соответствующих пререквизитных программах (программах обеспечения обязательных условий типа «правильных методов про­изводства, GMP) с оценкой рисков. Для практической реализации Микробиологической безо­пасности пищевых продуктов необхо­димо знать методы выявления, идентификации и количественной оценки как собственно микробиальной порчи, так и вызывающих ее микроорганизмов. Наряду с провокационным тестированием и HACCP-анализом приме­няются прогностические микробиологи­ческие модели. Хотя эти модели предна­значены прежде всего для определения роста, выживаемости и инактивации патогенов, по­стоянно разрабатываются модели для определения микроорга­низмов порчи.

Разнообразие микроорганизмов, которые вызывают порчу пи­щевых продуктов, требует, помимо пределов содержания пато­генных микроорганизмов, установления для них соответствующих границ. Многие традиционные способы консервирования были разработаны эмпирически, без полного понимания механизма дей­ствия используемого антимикробиального средства. При отказе от использования высокого содержания консервантов процессы переработки необходимо пересмотреть, как и сами основы консер­вирования. Контроль и регулирование микробиологической порчи по-прежнему являются очень актуальными.

Порчу пищевого продукта можно определить так: любое изме­нение продукта, делаю­щее его неприемлемым для потребления че­ловеком. Утрата продуктом желаемых свойств и их изменения свя­заны в основном с размножением микроорганизмов порчи и про­дуцированием ими внеклеточных ферментов: протеаз, липаз и карбогидраз. Контаминация микроорганизмами пищевых про­дуктов происходит на любых стадиях производства (начиная со сбора урожая и заканчивая употреблением готового продукта). Многие из них способны размножаться в пищевых продуктах и приводить к их порче. Проявляется микробиологическая порча образованием слизи, видимых невооруженным глазом колоний бактерий, дрожжей или плесеней, выделением газа, помутнением жидких про­дуктов, обесцвечиванием и изменением вкусовых ха­рактеристик. С порчей пищевых продук­тов ассоциируется наличие метаболитов: ацетона, метилэтилкетона и диметил­сульфона в говя­дине, этилового спирта, служащего индикатором изменений ка­чества термо­обработанных продуктов, включая консервы, марино­ванные куриные грудки, радуж­ную форель, или триметиламина в протухшей рыбе. По некоторым оценкам вследствие микробиоло­гической порчи теряется треть произведенных в мире пищевых продуктов.

С давних пор проблема микробиологической порчи пищевых продуктов известна в пивоварении: пиво портят молочнокислые бактерии, приводя к его помутнению, появлению кислого привкуса и неприятного запаха. Все пищевые продукты: молочные, яйца, фрукты, овощи, соки, рыба, мясо крупного рогатого скота и птицы могут подвер­гаться микробиологической порче, так как они явля­ются идеальным источником питательных веществ для микроорга­низмов.

 

7.1. ИНДИКАТОРЫ ПОРЧИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

В XX в. исследователи пытались увязать обнаруживаемые мета­болиты микроорга­низмов со степенью порчи мяса, что позволило бы прогнозировать срок его годности. Несмотря на большое число работ по изучению микробиологических изменений на поверх­ности мяса, физико-химические изменения, происходящие при колонизации микроорганизмами, изучены еще недостаточно. В процессе порчи эти изменения происходят в водной фазе мяса, в которой содержатся низкомолекулярные соединения: глюкоза, глюкоза-6-фосфат, молочная кислота, пируват, глюконат, пропионат, этанол, ацетат, аминокислоты, нуклеотиды, мочевина и водорастворимые белки. Эти субстраты последовательно катаболизирует микрофлора мяса,

У некоторых бактерий снижение содержания глюкозы вызывает переключение с сахарного на аминокислотный путь метаболизма. После утилизации бактериями глюкозы из поверхностного слоя они начинают метаболизировать другие субстраты, в частности свободные аминокислоты. При этом бактерии продуцируют протеолитические ферменты. Признаком утилизации аминокислот счи­тается увеличение концентрации аммиака. Повы­шение содержания аммиака сопровождается образованием других продуктов метабо­лизма аминокислот: аминов, индола, скатола и сульфидов, что при­водит к появлению характерного неприятного запаха испорченного мяса и повышению значения pH.

Методы идентификации микробиоты порчи. В пищевой промыш­ленности широко используют иммуннологические и молекулярно-генетические методы идентификации. В иммунологических методах используют известные антитела, способные вступать в био­химиче­ское взаимодействие с поверхностными антигенами конкретных бактерий, вызыва­ющих порчу или контаминацию пищевых про­дуктов (ИФА – ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) с применением иммуноферментного комплекса на носителе). Им­муноферментные комплексы на носителях используют для обнару­жения пищевых патогенов: Escherichia coli 0157:Н7, токсинов, про­дуцируемых золотистым стафило­кокком Staphylococcus aureus, и протеаз, выделяемых бактериями порчи рода Pseudo­monas. В молекулярно-генетических методах используют так называемые зонды, представляющие собой небольшие однонитевые сегменты ДНК, комплементарные участ­кам ДНК или РНК индуцируемых микроорганизмов (ПЦР и метод зондов). В случае присутствия в исследуемой пробе ДНК мертвых микроорганизмов при исполь­зовании метода ПЦР получают ложно положительные результаты. Проблемы могут возникнуть и вследствие присутствия ПЦР-ингибиторов, которые, как известно, присутствуют в матриксе сырной массы. Метод ПЦР требует затрат времени и поэтому нежелателен при серийных анализах.

Количественные методы определения численности микроорга­низмов в пищевых продуктах основаны на измерении АТФ-биолюминесценции, биоэлектрических явлений или микроскопии. Ме­тодом измерения АТФ-биолюминесценции устанавливают содер­жание АТФ в культуре бактериальных клеток. Недостаток метода заключается в том, что АТФ – основной источник энергии для биохимических реакций во всех живых клетках. Довольно много АТФ содержится в пищевых продуктах, что требует отделения ми­кробного АТФ от «фонового». Метод пригоден для определения уровня контаминации оборудования и рабочих поверхностей на пищевых производствах, и там он широко используется.

Методы измерения электрических явлений основаны на изме­рении изменений силы тока при размножении микроорганизмов. В ходе метаболизма бактерии превращают незаряженные частицы в заряженные, тем самым повышая проводимость данной среды. Среды, используемые в данном методе, могут быть общими или се­лективными, т.е. применяемыми для всех или только конкретных родов бактерий, дрожжей и плесеней, а также отдельных групп ана­лизируемых пищевых продуктов (например, сыров).

При использовании метода микроскопии микроорганизмы окрашивают флуорес­центными красителями и используют эпифлуоресцентный микроскоп. Проблема состоит в том, что живые и мертвые микроорганизмы окрашиваются одинаково, однако в настоящее время с появлением метода DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique – метод эпифлуоресцентного фильтра) ее удалось решить. Однако данный метод требует больших трудозатрат и за­трат времени. Метод совершенствуется – в последнее время по­явились полностью автоматизированные системы анализа.

Результаты сравнительного изучения методов количественного анализа на примере широко распространенного микроорганизма порчи мясных продуктов Brochothrix thennosphacta позволяют за­ключить, что проточная цитометрия является наиболее точным ме­тодом. Но имеются претензии к скорости данного метода, так как вызывающие порчу микроорганизмы необходимо предварительно изолировать от поверхности мяса, а поскольку они могут образовы­вать биопленку из гликокаликса, это бывает довольно затрудни­тельно.

С успехом опробовано несколько новых подходов к микробио­логическому анализу в целях ускоренного выявления порчи мясо­продуктов. Эти методы отнесены к «био­сенсорным» – амперометрическим методам обнаружения с использованием ферментных систем и электродов, способных измерять изменения в содержании диаминов, а значит, определять качество куриного мяса. Было по­казано, что точные результаты можно получить в течение 5 мин, но для подготовки образца с ферментной системой предварительно требуется еще 10 мин.

Сущность других подходов состоит в распознавании и количе­ственной оценке запахов, в частности, с помощью «электронных носов», которые состоят из системы электронных химических сенсоров, подсоединенной к системе распознавания образцов. «Элект­ронный нос» неплохо зарекомендовал себя при микробиологиче­ском анализе мяса и рыбы.

Системы «электронного носа» обладают недостатками: погреш­ностью в измерениях, утратой чувствительности в условиях повы­шенной влажности, проблемами точного калибрования, небольшим сроком службы, невозможностью получения количественных данных.

В заключение хотелось бы сказать, что методы обнаружения порчи мясопродуктов в основном не соответствуют своему назна­чению, очень трудоемки и требуют много времени, поэтому полу­чаемые данные запаздывают и отражают уже изменившуюся си­туацию.

Поскольку микробиологическая порча мясопродуктов представ­ляет собой комплекс­ное явление, усовершенствованные методы обнаружения микроорганизмов станет воз­можно применять и для анализа других пищевых продуктов, в которых микробио­логиче­ская порча не столь разнообразна. Более того, с помощью матема­тических моделей, учитывающих такие факторы, как температура и влажность, эти «ускоренные» методы позволят точно прогнози­ровать остаточный срок годности и найдут свое место в системах НАССР пищевых производств.

 

7.2. ИНДИКАЦИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДРОЖЖЕЙ, ВЫЗЫВАЮЩИХ ПОРЧУ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Наличие в пищевых продуктах сахаров, органических кислот и других источников углерода, как и низкое значение рН, способ­ствует порче продуктов под действием дрожжей. Признаками дрож­жевой порчи служат различные образования на поверхности мяса и сыра, а также брожение сахара в жидких и полужидких продуктах.

Среди дрожжей, вызывающих порчу пищевых продуктов (ДВПП), встречается довольно много видов, как аскомицетов, так и базидиомицетов.

Дрожжи, поражающие разные пищевые продукты, отличаются избирательностью. Безалкогольные напитки, сиропы, салатные дрессинги чаще подвергаются воздействию Zygosaccharomyces, а пиво и вино – Bretianomyces, Saccharomyces и ряда дрожжей других родов. В образцах испорченных мяса и сыров зачастую обнаружи­вается повышенное содержание дрожжей. Учитывая большое разнообразие возможных таксонов, правильная идентификация видов зачастую представляет большую проблему.

 

7.2.1. Индикация и количественный учет дрожжей

При установлении причин порчи продукта необходимо по­ставить вопрос: следствием чего являются наблюдаемые изме­нения – размножения микроорганизмов, изменений в рецептуре или условий хранения. При высокой степени порчи продукта ми­кроорганизмы, ее вызвавшие, могут быть обнаружены обычной ми­кроскопией при 400- или 500-кратном увеличении. Дрожжи при микроскопии окрашивают кристаллическим фиолетовым. Для этого маленькую каплю 0,5%-го кристаллического фиолетового вносят в продукт непосредственно на предметном стекле или сме­шивают с небольшим количеством продукта, разбавленным ди­стиллированной водой (1 : 10). Микроскопическое исследова­ние позволяет идентифицировать микроорганизм, вызвавший порчу.

Индикацию дрожжей из испорченных пищевых продуктов осу­ществляют методом посева на разные питательные среды. Рекомен­дуется использовать среду на основе дихлорана бенгальского розо­вого агара с хлорамфениколом (DBRC для выделения как плесеней, так и дрожжей. Среда ограничивает рост колоний плесеней, по­зволяя произ­вести более точный подсчет колоний. ДВПП обычно хорошо размножаются при 25°С на стандартном солодово-дрожжевом агаре (3 г дрожжевого экстракта, 3 г солодового экстракта, 5 г пептона, 10 г глюкозы, 20 г агара, 1 л воды, рН 5–7). Эту среду используют как для обнаружения, так и количественного опреде­ления стандартным методом чашечного подсчета. Необходимо рас­творить образец в 0,1%-м пептонном бульоне. Значение рН солодово-дрожжевого агара близко к нейтральному, поэтому рН среды доводят до 4,5 с помощью раствора соляной кислоты.

При анализе пищевых продуктов микробиологи широко ис­пользуют МЕА (агар на солодовом экстракте) и TGY (агар на триптоноглюкозном дрожжевом экстракте), причем последний более предпочтителен. Ускоренное обнаружение дрожжей, стойких к консер­вантам (Z. bailii и Z. bisporus), проводят на подкисленной МЕА (например, МАА, уксусно­кислый солодовый агар) или под­кисленной TGY (TGYA). В основную питательную среду (МЕА или TGY) добавляют 0,5%-й уксусной кислоты. Колонии дрожжей обычно становятся различимыми через 3–7 сут. Колонии могут быть представлены более чем одним видом дрожжей (из-за сходства внешнего вида колоний это может быть сначала незаметно). При попытке индикации Zygosaccharomyces (например, Z. bailii) и других видов дрожжей время, необходимое для их обнаружения в продукте, можно сократить путем инкубирования чашек с агаром при 30°С вместо 25°С. Следует учитывать, что некоторые виды дрожжей осмофильны (в частности, Z. bailii, Z. bisporus, Z. rouxii), поэто­му для посева можно использовать высокоосмотические пи­тательные среды на основе YM или TGY с добавлением 40% глю­козы. Разведенный образец окажется также высоко­осмотичным (например, 0,1%-й пептонный бульон с 40% глюкозы).

Для обнаружения отдельных видов Zygosaccharomyces и других дрожжей разработан ряд специальных кулътуральных сред, обла­дающих различной эффективностью. К ним относится, в част­ности, лизиновый агар, применяемый для различения видов дрожжей-несахаромицетов, когда они встречаются вместе с Saccharomyces cerevisiae, поскольку последние не утилизируют лизин как источник азота. Из охлажденных приправ были случайно выделены психрофильные виды Mrakia и Rhodosporidium, вызывающие порчу пищевых продуктов при низких температурах. Для выделения ука­занных видов дрожжей может понадобиться инкубация образцов таких пищевых продуктов при температуре 5–10°С.

Таким образом, основным способом обнаружения ДВПП явля­ется посев проб и ожидание проявления видимых признаков раз­множения микроорганизмов.

Метод не лишен недостатков, главный из которых – затраты времени. Метод измерения импеданса основан на свойстве микро­организмов при размножении изменять электропроводность пита­тельной среды. Этот метод был использован для обнаружения дрожжей, вызывающих порчу вина. В качестве метода оценки кон­центрации микро­организмов в пищевых продуктах и напитках при­меняется также измерение АТФ-биолюминесценции, так как АТФ содержится во всех живых клетках. С его помощью невозможно идентифицировать отдельные их виды. При анализе напитков име­ется другая возможность – продукт пропускают через мембранный фильтр, после чего проводится окрашивание клеток и их подсчет под микроскопом. Разработано несколько методов, основанных на анализе ДНК и позволяющих проводить ускоренное обнару­жение и количественную оценку микроорганизмов, вызывающих порчу пищевых продуктов.

 

7.2.2. Идентификация дрожжей

К методам идентификации дрожжей относят выявление морфо­логии клетки, опреде­ление способов формирования плодовых образований, способов сбраживания углеводов и утилизации азот- и углеродсодержащих соединений. Постоянно встает вопрос: на­сколько точны традиционные методы идентификации видов? Кстати, виды дрожжей, описанные до 1980 г., были идентифициро­ваны традиционными фенотипи­ческими методами. При сравнении с результатами идентификации на молекулярном уровне правиль­ными оказа­лись более половины из них. В ходе недавних исследо­ваний в области идентификации дрожжей около 75% ранее «неиз­вестных» видов было определено традиционными методами. На основании изложенного можно утверждать, что фенотипи­ческие методы до сих пор себя не изжили, хотя они требуют больших затрат труда и времени.

Фенотипическое описание дрожжей включает следующие этапы:

• определение способа деления клеток. Выявление способов размножения (почкова­нием или делением клеток), определение морфологии клеток (рис. 7.1);
• выявление наличия или отсутствия гифов и псевдогифов:
• выявление наличия или отсутствия половых образований;
• выявление способности сбраживать углеводы;
• определение способности к размножению на определенных углерод- и азотсодержащих, а также на других специфических культуральных средах.

Рис. 7.1.
Вегетативное размножение:
а – мультилатеральное почкование; б – биполярное почкование;
в – полярное почкование на широком (слева) и узком (справа) участках;
г – деление клетки; д – псевдогифы; е – истинные гифы

Вегетативное размножение. Виды дрожжей родов Saccharomyces, Zygosaccharomyces делятся путем мультилатерального почкования (рис. 7.1, а), тогда как Hamemaspora – путем биполярного почкования (рис. 7.1, б). Базидиомицетам также свойственны разные типы почкования. Большинство из них размножается путем поляр­ного почкования
(рис. 7.1, в) – либо на узком основании, либо вблизи полюсов. Некоторым базидио­мицетам свойственно ти­пичное мультилатеральное почкование, тогда как другим свой­ственно и почкование, и деление (рис. 7.1, г). При исследовании молодой (24–48 ч) быстро развивающейся культуры почкующиеся клетки легко распознаются. Клетки же, размно­жающиеся деле­нием, вскоре образуют концентрическую колонию вокруг ис­ходной, так что способ размножения в данном случае не очевиден.

Дрожжи рода Candida (синоним Torulopsis) идентифицируют по критерию образо­вания псевдогифов, причем признается, что, хотя некоторые виды, классифицируемые как Torulopsis, образуют псевдогифы (рис. 7.1, д), мицелий такого типа образуют не все штаммы дрожжей рода Candida. Образование истинных гифов также может служить признаком, используемым для различения штаммов (рис. 7.1, е).

Половые образования. Половые образования нередко формиру­ются перед конъюгацией, которая происходит или между от­дельными клетками, или между клеткой и ее почкой (рис. 7.2). Если в качестве конъюгата выступает почка, то место соединения зачастую слегка удлиняется и стенка почки под микроскопом может выглядеть тоньше. Виды, для которых характерна конъю­гация между клеткой и ее почкой, почти всегда гомоталломны.

Рис. 7.2.
Типы конъюгации клеток:
а – конъюгация между отдельными клетками; 
б – конъюгация между клеткой и ее  почкой, слегка удлиненной

Неконъюгированные аски образуются как гомо-, так и гетероталломными диплоид­ными штаммами. Неспособность штаммов формировать половые образования может свидетельствовать об отсутствии необходимых условий или о принадлежности данной культуры к родственному типу.

Большинство микробиологических лабораторий идентифици­рует ДВПП феноти­пическими методами. Они очень трудоемки, требуют продолжительного времени и зачас­тую дают неопреде­ленный результат. Повысить надежность идентификации позво­ляя­ет способ с использованием микротитровальных кювет, включающий сравнительно большое количество тестов, основанных на про­цессах культивирования. Но если при исполь­зовании стандартных тестов существует определенная вероятность ошибочности иден­ти­фикации, не следует ожидать большей точности и от ускоренных методов идентификации.

Методы анализа на молекулярном уровне являются быстрым и точным средством идентификации видов микроорганизмов. Их можно использовать в том числе и для обнаружения новых видов ДВПП. Потребность в количественной оценке генетического сходства штаммов и видов на молекулярном уровне была удовлет­ворена, в частности, благодаря методике реассоциации или гибри­дизации ядерной ДНК. ДНК из двух представляющих интерес видов разделяют, смешивают и выделяют однонитевую последова­тельность, после чего степень сходства определяют по уровню реас­социации. Для измерения применяют различные способы: как спектрофотометрические, так и с помощью радиоизотопов или других маркеров. Результат измерения комплементарности ДНК обычно выражают процентом связанности, но он может вводить в заблуждение, так как цепочки ДНК перед дуплексированием должны иметь подобие базовых сегментов не менее 75–80%, а ре­зультаты должны соотноситься со шкалой сходства. Существенное влияние на образование двойной спирали ДНК оказывают условия эксперимента, однако при проведении измерений в оптимальных условиях различные методы оценки сходства ДНК дают практи­чески одинаковый результат. Процент сходства ДНК позволяет примерно оценить общее подобие геномов двух микроорганизмов, однако данным методом невозможно обнаружить различия в одном гене или безошибочно определить плоидность, хотя в некоторых случаях может быть выявлена анеуплоидия.

Основной вопрос: как интерпретировать данные о реассоци­ации ДНК? Считается, что по общему фенотипу штаммы с 80%-м и более сходством ядерной ДНК относятся к одному виду дрожжей. Данное положение было проверено на основании концепции био­логического вида – насколько способность к воспроизведению от­дельных штаммов связана с разной степенью сходства ДНК. Было показано, что виды с 25%-м сходством ДНК дают огромное число способов межвидового спаривания, но при этом образование асков ограничено, а аскоспоры вообще не образуются. Поскольку ви­довые барьеры очень сложны и определяются разными факторами, индикатором принадлежности микро­организмов к одному виду должно считаться сходство ДНК в 70–100%.

Наиболее надежным молекулярным методом сегодня представля­ется определение последовательностей ядерно- и митохондриально-кодированных генов, однако собственно процесс секвенирования гена можно провести далеко не в каждой лаборатории. Следова­тельно, необходима разработка ускоренных и простых в применении методов идентификации на молекулярном уровне. Благодаря ме­тодам, основанным на полиме­разной цепной реакции (снятие «отпе­чатков пальцев» ПЦР-микросателлитов, типи­рование), в настоящее время существует возможность дифференциации отдельных штаммов ДВПП, принадлежащих как к одному виду, так и к разным видам, а также установления источника их происхождения. Но эти методы типирования, скорее всего, вскоре будут вытеснены методами с ис­пользованием зондов, чипов и т.п.

 

7.3. ИНДИКАЦИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЛЕСЕНЕЙ, ВЫЗЫВАЮЩИХ ПОРЧУ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

В процессах порчи пищевых продуктов и их ферментации участвуют плесени, представляющие собой гифовые грибы, неко­торые виды которых продуцируют мико­токсины. Меры контроля роста плесеней в пищевых продуктах путем предотвращения попа­дания их спор в пищевые продукты, посредством регулирования температуры, влажности и содержания кислорода в условиях хра­нения изделий, с помощью консервантов и других пищевых до­бавок полностью не исключают возможности воздействия плесеней на качество и безопасность пищевых продуктов. Поэтому необхо­димо уметь их обнаруживать в готовых изделиях, а также в ходе процессов переработки, упаковки и хранения пищевых продуктов.

До середины XX в. плесени идентифицировали методом культи­вирования на питатель­ных средах в чашках Петри с последующим микроскопированием. В дальнейшем для подавления размножения бактерий питательные среды начали подкислять, что способ­ствовало размножению дрожжей и плесеней, однако особо специ­фической среды подобрать не удалось. Впоследствии подкисленные питательные среды были заменены средами с антибиотиками, биохимическими реагентами или красителями, замедляющими рост бактерий и позволяющими развиваться дрожжам и плесеням.

 

7.3.1. Современные методы количественного определения плесневых грибов

Методы посева. Образец взвешивают, смешивают с разбави­телем и помещают на агар, после чего чашки инкубируют при за­данной температуре в течение 5 сут. Одновременно подсчитывают плесени и дрожжи, так как плесени вполне отличимы от дрожжей по характерным гифам. Масса образца может составлять от 5 до 400 г; образец смешивают с 0,1%-м понтонным бульоном и разбавляют в пропорции 1 : 10 или 1 : 5. Любой фрагмент мицелия, имеющий неповрежденные ядро и споры, способен образовывать колонии.

Для количественного определения плесеней используют не­сколько сред, поскольку универсальной среды до сих пор не разра­ботано. Рекомендуется использовать агар Чапека, декстрозный агар Сабуро, глюкозный агар на основе дрожжевого экстракта, агар на солодовом экстракте, питательную среду общего назначения – агар для определения микробного числа с добавлением по 100 мг хлорамфеникола и хлортетрациклина.

Следует отметить: одно из ограничений методов количе­ственного определения плесеней состоит в том, что не существует одной универсальной среды для выделения и количественного определения всех видов плесеней для всех возможных пищевых продуктов. Поэтому рекомендуется применять различные культуральные среды.

Поскольку в большинстве пищевых продуктов может разви­ваться несколько видов плесеней, для микологического анализа таких продуктов может потребоваться несколько сред и разные условия инкубирования, особенно если требуется определить не только их количество. Еще одним лимитирующим фактором яв­ляется отсутствие единых правил по выбору антибиотика для по­давления размножения бактерий.

Методы фильтрации. Сущность метода, в котором применяется гидрофобный мембранный фильтр, заключается в том, что в про­цессе фильтрации жидкий образец (или твердый в растворе) про­ходит через фильтрующий элемент с предварительным фильтром (размер пор – 5 мкм; используется для удаления частиц пищевого продукта). За первым расположен второй мембранный фильтр (размер пор – 0,45 мкм) с гидрофобной сеткой, способный улавли­вать отдельные клетки. Этот фильтрующий элемент помещают в чашку Петри на агар КМ-11, содержащий краситель-индикатор и антибиотик, и проводят инкубирование при температуре 25 ± 1°С в течение 50 ± 2 ч, после чего подсчитывается количество ячеек с колониями.

Методы подсчета гифов по Ховарду. Данный метод основан на стандартизированном методе, с помощью которого вычисляется процент микроскопических полей с гифами плесени, которые пре­вышают по размеру 1/6 диаметра поля. Перед тем как использовать данный метод, необходимо научиться различать клеточную ткань продукта, не содержащего плесени, структуры инородных вклю­чений животного или растительного происхождения и собственно плесени. Гифы плесени состоят из продольных трубок, поперечных перегородок, разделяющих гиф на отдельные участки, клеточного материала в форме гранул, разветвлений гифов, их концов, не спо­собных преломлять свет, однако не в каждом образце все они при­сутствуют.

 

7.3.2. Идентификация плесеней

Растущие на поверхности пищевых продуктов плесени могут быть идентифицированы опытными микологами на уровне рода путем визуального наблюдения и микроскопии. Стерильной инокуляционной спицей проводят сквозь колонию плесени и под ее поверх­ностью, захватывая отдельные фрагменты мицелия. Мате­риал переносят на двойное предметное стекло. Если плесень не сходит со спицы, ее смачивают каплей 70%-го этанола и удаляют краешком покровного стекла. Препарат исследуют под микро­скопом при 40-кратном увеличении. Если для анализа цельных или дифференцированных структур требуется большее увеличение, то на покровное стекло наносят одну каплю иммерсионного масла и повышают увеличение до 100-кратного.

Изолированные из пищевых продуктов методом посева плесени идентифицируют путем микроскопии в соответствии с методами анализа, рекомендуемыми в справочниках по таксономии плесеней пищевого происхождения. Существует список таксономических признаков для идентификации выделяемых из пищевых продуктов плесеней. Полезны также руководства по таксономии плесеней от­дельных родов – Aspergillus, Fusarium и Penicillium. Традиционно плесени определяют по таксономическим «ключам», в которых описаны их макроскопические и микроскопические характе­ристики после выращивания на селективной среде при опреде­ленной температуре в течение заданного времени.

Разрабатываются новые методы и аналитическое оборудование с целью иденти­фика­ции плесеней – это разработка иммунологических тест-наборов, определение летучих соединений, молекулярные методы, основанные на анализе нуклеиновых кислот,
ИК-спектроскопия и другие системы распознавания спектров.

Иммунологические тест-наборы разработаны для Altemaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Monascus, Mucor, Penicillium и Rhizopus. В тест-наборах используют антитела к компонентам клеточных стенок, внеклеточных полисахаридов и гликопротеинов плесеней. Имеется неспецифичный тест-набор на основе метода ELISA, способный обнаруживать в смеси шести родов плесеней (Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Mucor и Penicillium), а также плесени 10 других родов. Разработаны тест-наборы для обнаружения плесеней, продуцирующих микоток­сины: афлатоксин, трихоцетен и фумонизин.

Для контроля роста плесеней модифицируются и некоторые бактериологические методы, в частности проточная цитометрия, основанная на подсчете количества отдель­ных клеток в жидкости по мере их прохода через сенсорный датчик. Методы проточной цитометрии используются для обнаружения плесеней в воздухе с помощью разных параметров: размера частиц, гранулярности (бо­кового светорассеяния) клетки, а также красной флуоресценции при длине волны 620 нм после окрашивания и микроволнового об­лучения при мощности 440 Вт и частоте 2450 МГц в течение 30 с.

Разрабатываются современные методы идентификации плесеней: биосенсоры на основе ДНК и РНК, масс-спектроскопия, биолюминисцентные и другие подобные системы для их обнаружения в пи­щевых продуктах.

 

7.4. ПОРЧА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ

Микробиологическую опасность, связанную с порчей пищевого продукта сапро­фитными микроорганизмами, и микробиологиче­скую опасность продукта, обсемененного патогенными микроорга­низмами, следует разделять. И это понятно, потому что боль­шинство патогенных микроорганизмов, встречающихся в пищевых продуктах, не вызывает их порчи (опасный продукт может иметь хорошие органолептические свойства). В то же время микроорга­низмы порчи, не являясь патогенными, могут продуцировать ток­сины и микотоксины, а размножение некоторых микроорганизмов порчи может сопровождаться образованием биогенных аминов, в частности гистамина.

Биогенные амины имеют природное происхождение, они про­дуцируются в больших количествах также микроорганизмами порчи под действием декарбоксилаз аминокислот. Биогенные амины обнаруживаются в таких продуктах, как вино, ферментиро­ванные мясо- и рыбопродукты, сыры и квашеные овощи. Чрез­мерное потребление этих аминов связано с риском для здоровья.

Некоторые микроорганизмы порчи могут привести к пищевым отравлениям, но степень их патогенности не ясна или дискусси­онна. Существуют микроорганизмы порчи, которые можно отнести к патогенам с умеренной патогенностью (например, некоторые виды аэромонад, Aeromonas spp.). Такие патогены обычно без­вредны, но при ослабленном иммунитете они могут поражать ткани, вызывая заболевание.

Непатогенная микробиота пищевых продуктов может взаимо­действовать с пато­генными микроорганизмами и влиять на их рост, может ему способствовать. Это так называемый метабиоз, когда одни микроорганизмы изменяют условия окружающей среды так, что становится возможным размножение других. Это зачастую свя­зано с изменением значения рН. Известны результаты исследо­ваний, согласно которым рост некоторых дрожжей, плесеней или бактерий порчи в кислых продуктах приводит к такому увеличению значения рН, что становится возможным размножение бактерий Clostridium botulinum и продуцирование ими токсинов. Мягкая бак­териальная гниль плодов ведет к увеличению концентрации в них бактерий рода Salmonella и их преобладанию над другими микроор­ганизмами. Гриб Clomerella cingulata стимулирует размножение Listaria monocytogenes на яблоках, a Penicillium expansum их размно­жение подавляет.

Во многих странах микробиологический критерий безопасности продукта основан на наличии или отсутствии микроорганизмов, их численности, включая паразитические виды, а также на содер­жании их токсинов или метаболитов (на единицу массы, объема, площади продукта или партии). Бывает, что микробиологические критерии закрепляют в стандартах, рекомендуют и фиксируют в технических условиях. Закрепленный в стандарте микробиологи­ческий критерий указан в нормативном акте, а его выполнение обязательно (обычно он касается вопросов пищевой безопасности). Принятые техни­ческими условиями критерии применяются для сырья, ингредиентов или готовых изделий, являющихся предметом договоров купли-продажи.

Рекомендуемые критерии разрабатываются разными орга­нами – предприятиями и организациями пищевой промышленности, контролирующими организациями, нацио­наль­ны­ми и меж­дународными комиссиями, они чаще всего относятся к микроорга­низмам-индикаторам.

 

7.4.1. Микробиологическая порча молока и молочных продуктов

Молоко является прекрасной средой для размножения микро­организмов. Рост неже­лательных микроорганизмов отрицательно влияет на выход продукции, срок ее годности и органолептические показатели, что приводит к экономическим потерям.

По-прежнему актуальными остаются проблемы выявления источников контаминации и контроля роста микроорганизмов в сыром молоке и переработанных молочных продуктах. К улуч­шению их качества, увеличению срока годности и уровня безопас­ности привело не только внедрение нормативов и стандартов на ка­чество молока, но и приме­нение новых технологий санитарно-ги­гиенической обработки оборудования и помещений, а также процессов сбора, переработки сырья и дистрибьюции молочных продуктов.

Так как молоко – источник питательных веществ для многих групп и видов микро­организмов порчи, в качестве примера будут рассмотрены характерные для молока и молочных продуктов источ­ники контаминации, а также ее последствия для качества продуктов из сырого и обработанного молока.

Разнообразие микроорганизмов порчи сырого молока. Мерой риска порчи молока, индикатором здоровья молочного стада, сани­тарно-гигиенических условий при дойке и хранении молока явля­ется численность бактерий в сыром продукте. Микробиологическая безопасность молока непосредственно влияет на выход и качество молочных продуктов. Количество микроорганизмов в сыром мо­локе может изменяться в очень широких пределах: от > 10 КОЕ/см³ в молоке, полученном асептическим способом от здоровых коров, до > 1 · 10⁶ КОЕ/см³. Источниками контаминации молока микро­организмами являются вымя, сосковый канал и оборудование. Стандарты разных стран по сырому молоку отличаются друг от друга. Они обычно устанавливают численность микроорга­низмов, максимально допустимую для обеспечения безопасности и качества молочных продуктов.

Количество начальной микрофлоры в сыром молоке зависит от технологии получения, сбора молока и обращения с ним.

Микрофлора сырого молока представлена чаще всего молочно­кислыми бактериями Streptococcus spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., Micrococcus spp. и дрожжами. К порче готового продукта приводят микроорганизмы сырого молока. На скорость порчи су­щественно влияют температура и продолжительность хранения сы­рого молока. Все присутствующие в сыром молоке микроорга­низмы делят по оптимальным для их размно­жения интервалам тем­ператур на мезофильные, психротрофные и термотолерантные.

При увеличении числа молочнокислых микроорганизмов и сбраживании ими лактозы молоко приобретает кислый вкус и происходит створаживание казеинатов при нагре­вании. Исполь­зование эффективных систем охлаждения сырого молока предот­вращает его порчу из-за воздействия молочнокислых бактерий. Хранение сырого молока при температуре 4°С в течение 24 ч при­водит к изменению популяции бактерий от мезофильных (типа мо­лочнокислых бактерий) к психротрофным (например, Pseudomonas spp.). Когда сырое молоко быстро охлаждают и хранят при соответ­ствующих темпера­турных режимах (охлаждение до 7°С и ниже в те­чение 2 ч после получения), основной задачей поддержания его качества становится контроль наличия психротрофных организмов.

Психротрофы молока. Pseudomonas, Enterobacter, Flavobacterium, Klebsiella, Acinetobacter, Achromobacter, Aeromonas и Alcaligenes отно­сятся к грамотрицательным бактериям сырого молока. К грамположительным психротрофным бактериям относятся Coryneliacierium, Microbacterium, Micrococcus и спорообразующие Bacillus и Clostridium. В сыром молоке преобладают Pseudomonas spp. Часто встречаются в сыром молоке виды Pseudomonas: Pseudomonas fluorescens, Pseudo­monas putida, Pseudomonas fragi и Pseudomonas aeruginosa. Некоторые из названных видов продуцируют термоустойчивые липолитические и протеолитические ферменты, выдерживающие пастери­зацию, что объясняет причины ухудшения качества молока в те­чение срока годности готового продукта даже при уничтожении исходных бактерий при пастеризации.

Причинами загрязнения сырого молока психротрофами явля­ются плохие санитарно-гигиенические условия на фермах и ненад­лежащим образом вымытое технологическое оборудование.

Термотолерантные микроорганизмы молока. Термотолерантные виды микроорга­низ­мов выделяют как из сырого, так и из обрабо­танного молока. Термотолерантные споро­образующие микроорга­низмы, выдерживающие пастеризацию и способные к размно­­жению в термообработанных продуктах в условиях холодильного хранения, ухудшают качество продукта и сокращают срок его год­ности. Эти микроорганизмы могут выживать при пастеризации или других способах высокотемпературной обработки молока. Они проникают в сырое молоко из окружающей среды (например, из подстилки для скота) или с производственного оборудования. К термоустойчивым микроорганизмам сырого молока относятся Microbacterium, Micrococcus, Bacillus, Alcaligenes, Corynebacterium и Clostridium. Порчу молока чаще всего вызывают Bacillus spp. и Paenibacillus spp. – они способны к размножению в условиях хо­лодильного хранения и снижению качества готового продукта.

Нередко в молоко попадают микроорганизмы от коров, больных маститом, которые увеличивают общую численность бактерий мо­лока. К ним относятся Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis и Staphylococcus aureus. Наличие в молоке сборных танков таких ми­кроорганизмов, как Streptococcus uberis, связано не только с маститной инфекцией, но и плохо вымытым оборудованием.

Микроорганизмы, вызывающие инфицирование вымени, могут присутствовать в сыром молоке в больших количествах. От больных маститом коров в молоко попадают также соматические клетки, способные ухудшать качество молока. Показатель числа соматиче­ских клеток используют в качестве индикатора качества молока. Высокое зна­чение числа соматических клеток свидетельствует о наличии в стаде маститной инфекции. Из пороков вкуса и запаха в этих продуктах отмечаются прогорклость и горечь.

Контроль степени контаминации сырого молока при его сборе, транспортировке и хранении является определяющим фактором обеспечения безопасности готового молоч­ного продукта и его качества.

Микробиота порчи молочных продуктов.

Гнилостные бактерии. По морфологическим и физиологиче­ским признакам гнилостные бактерии принято делить на четыре группы:

• спорообразующие и неспорообразующие аэробы;
• спорообразующие анаэробы;
• неспорообразующие анаэробы;
• факультативные анаэробы.

Споры бактерий рода Bacillus обладают высокой термоустойчиво­стью и выдерживают пастеризацию, а в некоторых случаях стерили­зацию молока. Вследствие высокой актив­ности протеолитических и липолитических ферментов эти бактерии вызывают гидролиз белков и жиров с появлением в продукте горького и прогорклого вкуса. Развитие В. cereus и В. mycoides приводит к «сладкому» сверты­ванию (при низкой кислотности) сливок, сгущенного стерилизован­ного молока.

Аэробные спорообразующие бактерии. К типичным гнилостным аэробным палочкам, образующим эндоспоры, относятся Bacillus subtilis, Bacillus megatherium, Bacillus mycoides, B. circulans, B. licheniformis, B. Cereus, обладающие высокой протеолитической актив­ностью (разжижают желатин, свертывают и пептонизируют мо­локо, выделяют аммиак). Bacillus subtilis (сенная палочка) – прямые палочки с закругленными концами, иногда они располагаются ко­роткими цепочками, окраска по Граму положительная, в молодых культурах подвижны (перитрихи). Размеры клеток – (0,6–0,7) × (3–5) мкм. Сенная палочка образует эндоспоры, располагаю­щиеся центрально, причем диаметр спор превышает диаметр клетки. Колонии на мясопептонном агаре (МПА) имеют серо-белый цвет, они сухие и бугристые. При росте в мясопептонном бульоне (МПБ) на поверхности образуется сухая морщинистая пленка, бульон сначала мутнеет, а затем становится прозрачным. Оптимальная температура роста составляет 37°С, температурный диапазон – от 5 до 55°С. Bacillus megatherium – крупная палочка размером (1,5–2,0) × (3,5–7,0) мкм; она грамположительна, по­движна, располагается чаще всего цепочками, образует споры, рас­полагающиеся в центре клетки, капсул не формирует.

Аэробные неспорообразующие бактерии. К этой группе относятся бактерии родов Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes. Бактерии рода Pseudomonas – прямые или слег­ка изогнутые палочки раз­мером (0,5–1,0) × (1,5–5,0) мкм, грамотрицательные, подвиж­ные за счет одного или нескольких полярных жгутиков, спор и капсул не образуют, аэробы, окидазо- и каталазоположительные. Опти­мальная температура их роста составляет
18–22°С, температурный диапазон роста — 4–41°С. Колонии на плотной среде блестящие, с ровными краями, часто окрашенные благодаря наличию пигментов: желто-зеленого у P. fluorescens, синевато-зеленого у Pseudomonas aeruginosa, желто-оранжевого у Р. alkaligenes. Имеются и нефлюоресцирующие виды, например P. fragi. Типовой вид – Pseudomonas aeruginosa.

Псевдомонады являются доминирующими представителями психротрофных бактерий сырого молока. Чаще всего встречаются Р. fluorescens, P. putida, P. fragi, Р. aeruginosa. Многие виды псевдо­монад продуцируют термоустойчивые липазы и протеазы, которые выдерживают пастеризацию молока и, несмотря на гибель вегета­тивных клеток, вызывают порчу молочных продуктов в процессе их хранения.

Факультативно-анаэробные неспорообразующие бактерии. К этой группе бактерий относятся некоторые представители семейства Enterobacteriaceae (роды Escherichia, Proteus, Serratia) и рода Aeromonas.

Escherichia coli (кишечная палочка) – мелкие палочки размером (1,0–1,5) × (2–3) мкм, одиночные или парные, грамотрицательные, подвижные (перитрихи), спор и капсул не образуют, каталазополо­жительные, оксидазоотрицательные. Оптимальная температура роста составляет 37–39°С. На МПА палочка образует бесцветные, блестящие, слегка слизистые колонии с гладкой поверхностью и ровными краями. Кишечная палочка обладает слабой протеоли­тической активностью. Она не гидролизует молекулы казеина и свою ферментативную активность проявляет лишь на стадии рас­щепления пептонов.

Proteus vulgaris (палочка протея) – прямые палочки размером (0,4–0,8) × (1,2–3,0) мкм, грамотрицательные, подвижные (пери­трихи). Клетки имеют многочисленные фимбрии. Спор, капсул и пигментов не образуют. Представители рода Proteus легко иденти­фицируются благодаря своей способности к роению. Через не­сколько часов после посева в конденсационную воду свежеприго­товленного мясопептонного агара наблюдается роение микроба, его ползучий рост. Поверхность МПА покрывается тонкой вуале­образной полупрозрачной пленкой. Оптимальная температура роста микроба составляет 37°С, благоприятное значение pH – ней­тральное. Палочка протея при расщеплении белков образует серо­водород, индол.

Serratia marcescens – прямые палочки размером (0,5–0,8) × (0,9–2,0) мкм, подвижные, грамотрицательные, при опреде­ленных условиях способные образовывать капсулу. Выде­ляет пиг­мент ярко-красного цвета – продигиозин, за счет чего на МПА вырастают мелкие круглые блестящие колонии ярко-красного цвета, похожие на капли крови, отсюда названные «чудесной па­лочкой». Оптимальные: температура роста — 22–25°С, pH – 6,5. Расщепляет белки с образованием сероводорода, аммиака, индола.

Род Aeromonas – мелкие палочки с закругленными концами раз­мером (0,3–1,0) ×
× (1,0–3,5) мкм. Располагаются одиночно, парами или короткими цепочками. По Граму окраши­ваются отрицательно, подвижные за счет одного полярного жгутика. Опти­маль­ный диа­пазон температуры роста составляет 22–28°С. Оксидазо- и катала­зополо­жительные. Типовой вид – Aeromonas hydrophila.

Анаэробные спорообразующие палочки. Clostridium putriflcus – длинные палочки размером (0,4–0,7) × (7–9) мкм, располагаются одиночно или цепочками, грамположитель­ные, подвижные (перитрихи). Образуют эндоспоры, которые смещены от центра, их диаметр превышает диаметр клетки. Каталазоотрицательные. Штаммы этого вида обладают сильно выраженной протеолитической активностью: разжижают желатин и кровяную сыворотку, свертывают и пептонизируют молоко. При расщеплении белка па­лочки образуют сероводород, аммиак, индол. На кровяном агаре вокруг колоний наблюдаются зоны гемолиза. Этот вид является одним из наиболее распространенных возбудителей анаэробного разложения белков.

Clostridium sporogenes – палочки размером (0,6–0,9) × (3–7) мкм с закругленными кон­цами, грамположительные, подвижные; быстро образуют эндоспоры, обладающие высо­кой термоустойчи­востью (сохраняют жизнеспособность после выдержки в автоклаве при 120°С в течение 20 мин). Оптимальная температура роста со­ставляет 37°С, но могут расти и при 50°С. Наиболее распростра­ненный вид порчи – образование большего количества га­за при расщеплении белков, что может привести к раздуванию упаковки, бомбажу консервов.

Clostridium perfringens – крупная грамположительная палочка размером (5–8) × (1–2) мкм, неподвижная, образующая эндо­споры. Расположение спор субтерминальное или центральное. В организме человека или животного данная палочка способна образовывать капсулу. С. perfringens – анаэроб, быстро растет на питательных средах, особенно с добавлением глюкозы. В глу­бине МПА колонии имеют вид дисков или плотных комочков ваты. На поверхности кровяного агара образует влажные серовато-зе­леные колонии с четкой зоной гемолиза. На среде Вильсона–Блера, содержащей хлорид железа, колонии дискообразные, интен­сивно черного цвета с потемнением среды вокруг колонии. Рост микроорганизма в молоке сопровождается образованием губчатого сгустка, «подбра­сываемого» к ватной пробке пробирки за счет газо­образования. Оптимальная температура роста — 37–39°С. Вегета­тивные формы Сl. perfringens погибают при температуре 80°С через 30 мин, споры выдерживают кипячение в течение 1–2 ч.

Энтерококки. Это молочнокислые стрептококки кишечного происхождения, лишь недав­но перенесенные из рода Streptococcus в новый род – Enterococcus, включающий 16 видов. Типовой вид – Enterococcus faecalis. В настоящее время энтерококки наряду с бак­териями группы кишечной палочки считаются санитарно-показательными микро­организмами.

Enterococcus faecalis – клетки сферической или овальной формы размером (0,6–2,0) × × (0,6–2,5) мкм, располагающиеся парами или короткими цепочками. Грамположительны, эндоспор и капсул не образуют и, как правило, неподвижны. Факультативные анаэ­робы ферментируют углеводы с образованием L(+)-молочной кис­лоты. Оптимальная температура роста составляет 37–39°С, темпе­ратурный диапазон роста — 10–45°С. На МПА энтерококки обра­зуют мелкие, круглые, выпуклые блестящие колонии с ровными краями серовато-голубоватого оттенка. Энтерококки довольно устойчивы к неблаго­приятным факторам внешней среды. Они вы­держивают кратковременное нагревание при температуре 75–80°С, поэтому занимают большой объем в остаточной микрофлоре пасте­ризованного молока. Энтерококки обладают протеолитическими ферментами и вызывают появление горького вкуса в молочных продуктах и сырах. За счет выделяемого ими сычужного фермента происходит преждевременное свертывание молока.

Маслянокислые бактерии. Маслянокислые бактерии (Clostridium butyricum и Clostridium tyrobutyricum) относятся к группе сахаролитических клостридий, которые сбраживают сахара с образованием преимущественно масляной и уксусной кислот и газов (СO₂ и Н₂O). Благодаря своей газообразующей способности маслянокислые бак­терии вызывают такие виды порчи молочных продуктов, как «позднее вспучивание» сыров, бомбаж консервов. Присутствие ма­сляной кислоты придает продукту прогорклый вкус.

Clostridium butyricum – палочки размером (0,3–2,0) × (1,5–2,0) мкм с закругленными концами, часто располагающиеся парами или ко­роткими цепочками; капсул не образуют. Клетки со спорами могут иметь форму булавы или теннисной ракетки. В молодых культурах грамположительные и подвижные (перитрихи). В старых культурах подвижность утрачивается и окраска по Граму варьируется. Споры овальные или сферические, их диаметр больше диаметра клетки. Облигатные анаэробы, оксидазо- и каталазоотрицательные. Опти­мальная температура роста составляет 30–37°С, температурный диа­пазон — 10–65°С. Оптимальное значение рН — 7,0–7,4.

Термоустойчивые лактобациллы. В молочных продуктах часто размножаются термо­­устойчивые молочнокислые палочки, спо­собные выдерживать кратковременную пастеризацию при темпера­туре 85–90°С. Размножаясь в молоке и молочных продуктах, эти бактерии накапливают значительное количество молочной кис­лоты и вызывают порок «излишне кислый вкус», при котором ти­труемая кислотность может возрасти до
200–220°Т. Иногда раз­витие термоустойчивых молочнокислых палочек приводит к появ­лению в продукте тягучести и «нечистого» вкуса.

Одним из представителей этой группы является Lactobacillus delbrueckii. Данный вид включает три подвида: L. delbrueckii ssp.delbrueckii, L. delbrueckii ssp.bulgaricus, L. delbrueckii ssp.lactis. Па­лочки с закругленными концами размером (0,5–0,6) × (2–9) мкм, грамположительные, неподвижные; эндоспор и капсул не обра­зуют. В клетках часто наблюдается зернистость. Факультативные анаэробы, ферментируют углеводы с образованием D(–)-молочной кислоты. Оптимальная температура роста — 45–55°С, темпера­турный диапазон — 20–65°С. Каталазо- и цитохромотрицательные.

Мицелиальные грибы. Они способны размножаться на молочных продуктах как при низких температурах, так и при пониженных значениях активности воды a_w – от 0,94 до 0,60 (например, Xeromyces bisporus). Присутствие плесени на пищевом продукте де­лает его непривлекательным для потребителя. Наличие у мицелиальных грибов активных протеолитических и липолитических фер­ментов приводит к возникновению таких видов порчи, как непри­ятный запах, прогорклые вкус и запах, изменение структуры продукта. Среди мицелиальных грибов встречаются виды, образу­ющие микотоксины, что представляет опасность для здоровья че­ловека. Чаще всего на молочных продуктах размножается молочная плесень – Geotrichum candidum (синоним Endomyces lactis), образу­ющая белый бархатистый мицелий, гифы которого распадаются на отдельные клетки – оидии, называемые также артроспорами. Geotrichum candidum относится к высшим несовершенным грибам – дейтеромицетам.

Идентификация и подсчет микроорганизмов молока. К бактерио­логическим методам оценки качества молока относятся:

• стандартное определение численности микроорганизмов по­севом на чашках Петри (SPC);
• подсчет колоний с предварительной инкубацией (PIC – Preliminary Incubation Count);
• подсчет колоний после лабораторной пастеризации (LPC);
• подсчет колиформ (Coliform Count).

С помощью SPC-анализа можно получить данные об общей численности аэробных бактерий в молоке. Его сущность состоит в инкубации молока перед проведением анализа при температуре 12,8°С в течение 18 ч. Он используется для индикации бактерий, попав­ших в молоко с грязного оборудования или из других экзо­генных источников.

Теория, лежащая в основе PIC-анализа, заключается в том, что при температурно-временных условиях, которые создаются в ходе анализа, не наблюдается значительного размножения нормальной микробиоты (например, Streptococcus spp.), тогда как микро­орга­низмы, присутствующие в сыром молоке вследствие плохих сани­тарно-гигие­ничес­ких условий (обычно грамотрицательные психротрофы), в этих условиях активно размножаются. Результаты SPC-анализа после предварительной инкубации срав­ни­вают с ре­зультатами анализа неинкубированного образца. Это позволяет определить, насколько увеличилась численность бактерий в про­цессе инкубирования. Если данные PIC-анализа в 3–4 раза превы­шают данные SPC-анализа, то это считается доказательством недо­статочности мер предохранения молока от экзогенной контами­нации.

Сущность LPC-анализа состоит в пастеризации сырого молока при температуре 63°С в течение 30 мин. Затем молоко сразу охла­ждают до 10°С и производят посев. LPC-анализ применяют в целях подсчета термофильных бактерий, обычно попадающих в сырое молоко с грязного оборудования или от грязных коров.

Подсчет колиформ используется в качестве индикатора фекаль­ного загрязнения или контаминации из окружающей среды.

Жидкое молоко после обработки. Как и в микробиологических стандартах по сырому молоку, допустимая численность бактерий в пастеризованном молоке в разных странах различается. Числен­ность микроорганизмов в молоке после пастеризации обычно не превышает 1000 КОЕ/см³. В только что пастеризованном молоке микробиота обычно представлена термофильными организмами, обычными для сырого молока. Через некоторое время в него могут попасть и другие микроорганизмы (постпастеризационные контаминанты), источником которых могут служить технологическое оборудование и окружающая среда. Таким образом, причиной ин­дикации микроорганизмов в молоке, пастеризованном традици­онным способом (кратковременной высокотемпературной обра­боткой), является постпастеризационная контаминация из произ­водственной среды: с грязного производственного оборудования, из воздуха или вследствие контакта с персоналом. Это грамотрица­тельные микроорганизмы, особенно рода Pseudowonas, а также грамотрицательные Enterobacter, Klebsiella, Alcaligenes, Acinetobacter.

Устранение источников контаминации грамотрицательными постпастеризационными микроорганизмами увеличивает срок год­ности жидкого молока. При снижении содержания грамотрицательных постпастеризационных коптаминантов следующим по важнос­ти фактором возможной контаминации является присут­ствие и размножение психро­трофных спорообразующих термо­стойких микроорганизмов, в частности штаммов Bacillus spp. и Microbacterium spp. Из рода Bacillus чаще всего выделяются виды В. cereus, В. circulans, В. mycoides и В. licheniformis. Доминирующей микробиотой пастеризованного молока, помимо Bacillus, в котором обнаруживаются и размножаются психротрофы (Pseudomonas spp.), являются бактерии рода Paenibacillus. Эти бактерии сочетают спо­собность выдерживать пастеризацию и размножаться при темпера­турах холодильного хранения, что позволяет считать их микроорга­низмами, вызывающими порчу пищевых продуктов.

Представители родов Bacillus и Paenibacillus проникают в молоко из различных источников на протяжении пищевой цепи от ферм до молокоперерабатывающих пред­прия­тий. Попавшие в сырое мо­локо споры бактерий способны выдерживать пастериза­цию, прора­стать и размножаться в переработанном молочном продукте. Термотоле­рантные психротрофы могут также контаминировать продукт после пастеризации. Показано, что в продуктах из пасте­ризованного молока больше штаммов В. cereus, чем в сыром мо­локе, и это дает основания предполагать, что обсеменение проис­ходит на моло­ко­перерабатывающих предприятиях.

В. cereus и В. mycoides обусловливают «сладкое» свертывание (при низкой кислот­ности) и появление такого дефекта, как ко­мочки сливок. Штаммы Pseudomonas spp. продуцируют термоста­бильные внеклеточные липазы и протеазы, которые расщепляют компоненты молока и вызывают его порчу даже после уничтожения в ходе термо­обработки самих микроорганизмов. Липазы Pseudo­monas spp. вызывают появление у молока привкуса прогорклости или горечи. Расщепление протеазами казеина, помимо появления горького вкуса, вызывает свертывание и желирование молока.

Сыры. Присутствие и размножение в молоке дрожжей и плесеней обусловливают появление у него специфического привкуса. В твердых сырах могут размножаться колиформы, Clostridium spp. и плесени. Примером порчи сыра под действием бактерий слу­жит дефект вспучивания при позднем газообразовании, вызванный действием Clostri­dium tyrobutyricum. Бактерии С. tyrobutyricum попа­дают в сыр в основном из сырого молока, контаминированного ими вследствие контакта с навозом или ферментированным си­лосом. В 1 г такого силоса может содержаться более 1 млн спор Clostridium. Порчу мягких сыров могут вызывать психротрофные грамотрицательные палочки (Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter и Flavobaaerium), ответственные за неприятный запах и вкус про­дукта вследствие продуцирования ими липолитических и протеолитических ферментов.

Вероятным источником контаминации сырого молока спорами являются экскременты животных. Количество бактерий в навозе дойных коров и кормление их силосом плохого качества находятся в прямой зависимости. Качество кормов и санитарно-гигиениче­ские условия при дойке сильнее всего влияют на степень контами­нации сырого молока, в связи с чем их можно считать потенциаль­ными контрольными точками улучшения качества сырого молока и исключения спор клостридий.

Кисломолочные продукты. Причиной микробиологической порчи кисломолочных продуктов являются дрожжи, способные к размножению при температурах холодильного хранения и низких значениях pH. Причиной порчи йогуртов и сметаны обычно явля­ются дрожжи и плесени. Имеет место и бактериальная порча. Порча продукта в результате контаминации дрожжами происходит в основном из-за несоблюдения «правильных» методов произ­водства. В 1 см³ отобранных из торговли образцов йогурта было вы­делено более 66 дрожжевых клеток. Основными представителями дрожжей, вызывающих порчу, в образцах промышленного йогурта являются Candida lamata, Saccharomyces cerevisiae и Kluyveromyces marxianus.

Основными видами дрожжей в йогуртах признаются Candida lusitariiae, С. kassei, С. rugosa, Kluyveromyces fragilis и Saccharomyces cerevisiae. К дефектам, вызванным наличием дрожжевых клеток в упакованном йогурте, относится выделение газа при сбраживании субстрата дрожжами. К появлению в готовом продукте горького привкуса может приводить присутствие в молоке, используемом в производстве йогурта, большого числа термотолерантных Bacillus.

Протеолитическая активность ферментов термостойких бак­терий (Bacillus spp.) может привести к формированию горького при­вкуса. Колиформы (Escherichia, Enterobacter) и психротрофные ми­кроорганизмы типа штаммов Pseudomonas spp. могут вызвать порчу пахты.

Сливки. В пастеризованных сливках выявляют грамотрицательные бактерии Entero­bacteriaceae, Alcaligenes, Acinetobacter и Aeromonas, но преобладают штаммы Pseudo­monas spp. Срок годности сливок, как и пастеризованного жидкого молока, сокращается при отсут­ствии контроля постпастеризационной контаминации продукта психро­троф­ными Pseudomonas и колиформами. К грамположительным микроорганизмам сливок относятся Bacillus spp. и Corynebacterium. Психротрофные микроорганизмы (в частности, псевдо­монады и Bacillus cereus) в сливках вызывают такие дефекты, как появление признаков липолитической порчи и горького привкуса в результате протеолиза.

Сливочное масло и спреды с пониженным содержанием жира. Мо­лочные спреды представляют собой смеси молочного жира и расти­тельных масел или сливочное масло пониженной жирности. Спреды являются альтернативой сливочного масла и бывают как с высоким (72–80%), так и с очень низким содержанием жира (менее 30%).

В сливочном масле водная фаза, присутствующая в виде мелких капель, может способствовать размножению микроорганизмов. Спреды наиболее подвержены воздействию микроорганизмов. Важнейшую роль в сохранении качества масла и маложирных спредов, как и других молочных продуктов, играют качество сы­рого молока и контроль контаминации продукта психротрофными микроорганизмами в процессе его производства, транспортировки и хранения. Фруктовый запах, протеолитическая активность и прогоркание могут быть обусловлены жизнедеятельностью псевдомонад (P. fragi, P. putrefaciens). Прогоркание масла вызывается термоустой­чивыми липазами и протеазами, продуцируемыми штаммами Pseudomonas spp., а липолитическая порча масла – жизнедеятельно­стью бактерий рода Micrococcus (эту порчу можно предотвратить хра­нением масла при температуре ниже 5°С).

Порчу масла и молочных спредов могут вызывать дрожжи и пле­сени. К порче сливочного масла могут привести плесени Rhizopus, Geotrichum, Penicillium, Alternaria, Aspergillus и Cladosporium, а также дрожжи Rhodotorula, Cryptococcus и Candida. Они способны испор­тить продукт даже при хранении в холодильнике.

Микробиологическая безопасность при производстве и перера­ботке молока.

Производство молока. Молоко, поступающее в вымя здоровой коровы, практически стерильно. Поскольку контаминация молока микроорганизмами возможна на ферме, уменьшению ее риска в процессе дойки, охлаждения и хранения молока способствует со­блюдение гигиенических мер. Причинами контаминации при дойке и сборе молока являются инфекции вымени, плохая мойка вымени и сосков, а также грязные поверхности оборудования для дойки и охлаждения, контактирующие с молоком.

Молоко от коров, больных гастроэнтеритом, маститом, следует сливать в отдельные емкости, что снижает численность бактери­альных и соматических клеток в молоке в общем сборнике. Во избе­жание попадания бактерий в молоко перед дойкой рекомен­дуется промывать вымя и соски водой с дезинфицирующим средством. Регулярная мойка оборудования и обязательные санитарно-гигиениче­ские мероприятия (очистка поверх­ностей оборудования, его дезин­фекция и дренаж) снижают численность бактерий и предотвращают образование биопленки. Если ежедневно не удалять грязь и бак­терии, это может привести к формированию образующих биопленку бактериальных сообществ, которые намного труднее удалять с по­верхностей оборудования, чем отдельные вегетативные бактери­альные клетки.

Переработка молока. На молокозаводе источники контами­нации молока микро­организмами – пастеризаторы, оборудование для сборки картонных коробок, насадки установок розлива, упако­вочные материалы и воздушная среда предприятия. Во многих странах широко распространена безразборная мойка оборудования, однако при ее ежедневном использовании в труднодоступных для моющих и дезинфицирующих средств местах (муфты, слепые участки и колена труб) бактерии могут выживать. Формирование биопленки в местах контакта оборудования с молоком способствует выживанию бак­терий, что может привести к появлению посто­янных источников контаминации.

Наличие в производственной среде постпастеризационных контаминантов приводит к быстрой порче продукта, сокращению срока его годности. Срок годности жидкого молока может быть значительно увеличен путем контроля и удаления микроорга­низмов, способных контаминировать продукт после пастеризации.

Надежным методом предотвращения повторной контаминации пастеризованного молока является применение «ультрачистого» розлива, который представляет собой фасование обработанного молока в регулируемой газовой среде, что минимизирует воз­можный контакт продукта с микроорганизмами. Увеличения срока годности молочных продуктов добиваются с помощью повышения температуры пастеризации и исключения или замедления размно­жения типичных представителей постпастеризационных микроор­ганизмов порчи. Сроки годности молочных продуктов продляют, применяя асептическую упаковку, что подразумевает стерилизацию собственно упаковки и фасование в нее стерильного продукта в асептических условиях.

Соблюдение температурных режимов. Выдерживание молока и молочных продуктов при температурах, ниже требуемых для раз­множения микроорганизмов порчи, – важный фактор контроля порчи молока на фермах и в процессе его переработки. Сразу же после сбора молока его охлаждают до 7°С и ниже, что подавляет рост мезофильной и термофильной микробиоты. На современных молочных фермах сырое молоко хранят в охлаждаемых резервуарах и перевозят на молокозавод в охлаждаемых молочных автоци­стернах. Эффективные системы охлаждения позволяют реже соби­рать молоко с удален­ных ферм и обеспечивают более продолжи­тельное хранение на них сырого молока. Во время добавления вновь поступившего молока в сборный резервуар температура охла­жденного молока в нем не должна превышать 10°С. Для предотвра­щения повышения температуры молока в сборном резервуаре при добавлении в него более теплого молока к последнему применяют системы предварительного охлаждения.

После пастеризации для сохранения качества молока требуется его быстрое охлаждение. С целью сохранения микробиологической безопасности пастеризованного продукта температура хранения должна быть не выше 4°С. Чем ниже температура хранения, тем длительней срок годности поступающего на реализацию жидкого молока. Температура в местах реализации и у потребителей может варьировать в широких пределах, что, естественно, отражается на сроке годности продукта.

Способы предотвращения порчи молока.

Тепловая обработка. На современном этапе развития технологий ведущую роль в обеспечении безопасности молочных продуктов иг­рает тепловая обработка. Она также позволяет увеличить срок год­ности молока и производить кисломолочные продукты оди­нако­­вого качества в результате сокращения численности или уничто­жения конку­ри­рующих микроорганизмов.

Наиболее широкое распространение получили следующие спо­собы тепловой обра­ботки сырого молока: пастеризация, ультрапас­теризация и ультравысоко­темпе­ратурная обработка (УВТ-обработка). Санитарная цель пастеризации молока состоит в элиминации всех характерных для молока неспорообразующих патогенных ми­кроорганизмов.

Самым стойким по отношению к высоким температурам неспорообразуюшим микроорганизмом считается Coxiella burnetii. В на­стоящее время содержание микро­организмов этого вида в пробах молока, подвергнутого термообработке, количественно опреде­ляется лишь косвенными методами (с помощью выявления и оценки концентрации антител у некоторого животного-«хозяина», выпившего это молоко, которым чаще всего выступают морские свинки). Количество С. burnetii измеряют в ИДМС (инфицирующих дозах для морской свинки). ИДМС соответствует наиболее вы­сокой дозировке десяти­кратно разбавленного молока, вызывающей не менее четырехкратного увеличения титра антител, вырабатываемых организмом морской свинки в качестве реакции на заражение С. burnetii. Наиболее высокое содержание С. burnetii, выявленное в молоке инфици­рованных коров, составило 10 000 ИДМС. По­этому для обеспечения достаточной безо­пасности в качестве мини­мальных условий пастеризации необходимо подобрать такие ре­жимы, при которых термически уничтожаются С. burneiti в коли­честве 100 000 ИДМС.

Пастеризация не только уничтожает патогенные виды неспорообразующих бактерий, но и сокращает содержание в молоке ми­кроорганизмов порчи при сохранении его органо­лептических свойств и пищевой ценности. Существует несколько температурно-времен­ных режимов, допускаемых при температурной обработке молока:

• длительная низкотемпературная пастеризация (Low-Temperature Long-Time, LTLT, или «пастеризация в резервуаре»);
• «пастеризация в резервуаре», которую обычно применяют для молока, предназначенного для изготовления йогуртов и сыров; минимальная температура в этом случае составляет 63°С, а ми­нимальное время – 30 мин;
• минимальные временно-температурные режимы при «пастери­зации в резервуаре» (72°С в течение 15 с);
• кратковременная высокотемпературная пастеризация (HTST).

Суть ультрастерилизации состоит в выдержке молока при тем­пературе не менее 138°С в течение не менее 2 с. Цель данного спо­соба – увеличение срока годности продукта по сравнению с тради­ционной кратковременной высокотемпературной обработкой бла­годаря более эффективному снижению численности бактерий. УВТ-стерилизация проводится при температурах 140–150°С в те­чение 1–2 с.

Ультрастерилизация позволяет продлить срок годности про­дукта при хранении ниже 7°С до 60–90 сут. Срок годности такого молока после вскрытия упаковки не превышает срока годности мо­лока после традиционной пастеризации. Порча молочных про­дуктов, подвергнутых ультрастерилизации, объясняется в основном ферментативной активностью термостабильных ферментов, проду­цированных микроорганизмами еще до стерилизации.

Нагревание продукта до нужной температуры производится либо в пластинчатых теплообменниках (косвенно), либо путем пропускания через продукт острого пара (прямой контакт с тепло­носителем). В молочной промышленности чаще применяют второй способ. В дальнейшем молоко фасуют в стерилизованную тару для предот­вращения контаминации продукта после стерилизации. УВТ-стерилизованное молоко можно хранить 3–6 мес при ком­натной температуре (25°С). К микроорганизмам порчи, выделяемым в УВТ-стерилизованном молоке, относятся термостойкие виды тер­мофиль­ных микроорганизмов, в основном Bacillus stearothermophilus, которые вызывают плоскокислое свертывание.

Эффективность тепловой обработки. Снижение количества ми­кроорганизмов в пастеризованном молоке зависит от качества сы­рого молока, температуры и продол­жительности тепловой обра­ботки, а также от численности и термостойкости присутству­ющих в молоке микроорганизмов.

Для прекращения размножения микроорганизмов сырое молоко после сбора следует охладить и хранить до тепловой обработки при температуре не выше 7°C. Численность микроорганизмов в сборном молоке до пастеризации не должна превышать нормативных пока­зателей ((3,0–5,0) · 10⁵ КОЕ/см³). Если численность бактерий в сыром молоке превышает ПДК, приведенные в нормативных актах, повышается вероятность их выжи­вания при тепловой обра­ботке. Производители молока должны тщательно контролировать и фиксировать продолжительность и температуры обработки мо­лока. Для отвода любого продукта, не прошедшего соответствующей температурной обработки, разработаны специальные контрольно-измерительные приборы (насосы и расходомеры).

Использование диоксида углерода. Диоксид углерода уже довольно давно применяют для подавления роста микроорганизмов в сыром и пастеризованном молоке. Исследуются возможности его исполь­зования и в производстве других молочных продуктов, в частности йогурта и сыра коттедж. Диоксид углерода следует применять для увеличения срока годности продуктов, произведенных из обрабо­танного молока в сочетании с охлаждением, пастеризацией и упа­ковкой, обладающей высокими барьерными свойства­ми. При уве­личении концентрации СO₂ скорость размножения бактерий сни­жается. В охлажденном сыром молоке СO₂ ингибирует размножение психротрофной микробиоты и снижает содержание микробных протеиназ и липаз. Очень важно, чтобы СO₂ исполь­зовался в кон­центрации, лежащей ниже порогового уровня восприятия чело­веком, чтобы он не стимулировал продуцирование токсинов и не способствовал прорастанию спор анаэробных спорообразующих микроорганизмов типа Clostridium botulinum. Добавление СO₂ в уме­ренных концентрациях (9,1–11,9 ммоль) в пастеризованное охла­жденное жидкое молоко не приводит к ускорению порчи под воз­действием Bacillus cereus или повышению риска заболевания боту­лизмом в результате жизнедеятельности Clostridium botulinum. Упаковка в модифицированной газовой среде (МГС) подразуме­вает применение повы­шен­ных концентраций СO₂ с использова­нием других газов или без них. В составе газовых смесей могут ис­пользоваться следовые количества СО, N₂O и SO₂, однако наи­большее распространение в пищевой промышленности получили СO₂, азот и кислород.

Микрофильтрация. Альтернативой методам термической обра­ботки (в частности ультрапастеризации) является микрофильтрация, позволяющая сократить численность бактерий в жидком молоке или сыворотке. Микрофильтрация сохраняет вкус продуктов по срав­нению с терминированными, поскольку исключается появление па­стериза­ционного и других посторонних привкусов и запахов. Ми­крофильтрационные мембраны имеют поры размером 0,2–5,0 мкм. Рабочее давление достаточно низкое (0,05–0,20 МПа). Микро­фильтры задерживают бактерии размером 1–3 мкм, а также глобулы жира, в связи с чем такая технология более приемлема для обезжи­ренных молочных продуктов.

Количество микроорганизмов и спор в молоке после микрофиль­трации сокращается соответственно на 99,99 и 99,95%. Так как споры психротрофных микроорганизмов рода Bacillus spp. способны выжи­вать при пастеризации, удаление спор микрофильтрацией снижает порчу молочных продуктов. На эффективность удаления микроорга­низмов влияют тип используемого фильтровального оборудования, его конструкция и конфи­гу­рация. Микрофильтрацию применяют в молочной промышленности для получения питье­вого молока с увеличенным сроком годности и молока-сырья для изготовления сыров.

Микрофильтрация молока для изготовления сыров предот­вращает вспучивание сыра благодаря удалению из молока-сырья спор Clostridium tyrobutyricum, при этом удаляются также споры других микроорганизмов, которые могут ухудшить качество сыра. Недостаток метода переработки – обезжиривание молока-сырья, хотя обезжиренное молоко после микрофильтрации для дости­жения желаемого содержания молочного жира в молоке-сырье для производства сыров может быть смешано со сливками.

Современные технологии. К технологиям, повышающим микро­биологическое качество и способным увеличить срок годности мо­лочных продуктов, относят микрофильтрацию и применение CO₂. Активно изучается возможность применения высокого гидростати­ческого давления и внесения антибиотиков в целях снижения чис­ленности микроорганизмов и увеличения срока годности молочных продуктов и сыров.

Суть обработки под давлением состоит в приложении к пище­вому продукту равномерного давления 20–1000 МПа, разрушаю­щего мембраны и структуры бактериальной клетки. Для инакти­вации вегетативных клеток достаточно давления 100–400 МПа. Для уничтожения бактериальных спор понадобится более высокое давление. В качестве альтернативы термообработке молоко-сырье для производства свежих и выдержанных сыров обрабатывали под высоким давлением. Помимо инактивации микроорганизмов жид­кого молока, у этой технологии имеется и еще одно преиму­щество – ее применение практически не сказывается на вкусовых свойствах продукта. Вместе с тем давление может влиять на струк­турные и функциональные свойства молочного белка, а следова­тельно, при производстве сыра оно может сказаться на выходе го­тового продукта, протеолизе и влагоудерживающей способности сыра.

 

7.4.2. Микробиологическая порча мяса и птицы

Под названием «красное мясо» обычно подразумевают мясо ко­пытных животных (говядину, телятину, свинину и баранину, реже козлятину).

При убое, разделке туш, транспортировке и хранении мясо может быть конта­минировано микробиотой из различных источ­ников. Первый и основной источник микробиоты – больное жи­вотное, далее идут желудочно-кишечный тракт, шкура животного, руки рабочих, вода, воздух помещений, нож для обескровливания, емкости, транспортировка и хранение, лимфатические узлы.

Если содержимое желудочно-кишечного тракта попадает на по­верхность туши, то вместе с ним туша обсеменяется множеством микроорганизмов. Со шкуры микро­организмы попадают в тушу с ножа для обескровливания во время вскрытия вен у крупных жи­вотных и снятия шкур. Часть микрофлоры шкур может перено­ситься по воздуху и загрязнять поверхность обволошенных туш. Использование перчаток не предотвращает попадания микроорга­низмов с одной туши на другую. Нестерильные емкости – пер­вичный источник загрязнения измельченного мяса и мясного фарша. Довольно значимый источник микроорганизмов для убойных животных – циркули­рующий воздух.

Микробный состав поверхности туши свидетельствует о ее за­грязнениях в процессе убоя и обработки. Грамположительные бак­терии с лактобактериями включают и энтерококки. Обнаружива­ются также грибы родов: Penicillium, Mucor и Cladosporium.

Продукты из мышечной ткани являются важным для здоровья населения пищевым сырьем с ценными питательными свойствами. Употребление в пищу испорченного или контаминированного ми­кроорганизмами мяса сопряжено с рисками для здоровья: можно заболеть сальмонеллезом, кампилобактериозом, листериозом или геморрагическим колитом.

Мясо крупного рогатого скота и птицы считается испорченным при изменении его внешнего вида, появлении неприятного запаха, слизи. Такие органолептические изменения мяса, проявляющиеся вместе или в отдельности, делают его неприемлемым для употре­бления. Обнаруживаемое ухудшение органолептических свойств мясопродуктов является результатом разложения тканей с последу­ющим образованием метаболитов, вызванным размножением и катаболической активностью микроорганизмов. Такие органолепти­ческие изменения могут быть обнаружены визуально или по появ­лению неприятного запаха – все зависит от видов колонизирующих микроорганизмов, общих характеристик или типа мяса и птицы, способа их переработки и условий хранения.

Мясо считают продуктом, наиболее подверженным порче, так как его влажная поверхность, богатая питательными веществами, особенно активно колонизируется бактериями порчи, в после­дующем быстро размножающимися. Поэтому далее текст будет по­священ индикаторам порчи мяса.

Было установлено, что на начальной (наблюдаемой) стадии про­исходит прикрепление бактериальных клеток к поверхности мяса, названное свободной и обратимой сорбцией. На второй (необра­тимой) стадии происходит продуцирование бактериями слоя лип­кого вещества полисахаридной природы – гликокаликса, приво­дящее к формированию биопленки. Активность присоединения бактерий зависит также от вида микробиоты, уже присутствующей на поверхности мяса, подвижности микроорганизмов, стадии их роста, физических факторов, в том числе структуры поверхности и температуры.

Скорость порчи мяса микроорганизмами находится в зависи­мости от условий хранения, способствующих размножению бак­терий (высокая влажность, температура
от –1 до +25°С). Признаки порчи могут появляться в результате деятельности следующих родов микроорганизмов: Pseudomonas, Moraxella, Psychrobacter, Escherichia, Brochothrix, Aeromonas, Bacillus, Staphylococcus, Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc и Acitietobacter. Доминирующими микроорганизмами порчи в боль­шинстве случаев являются грамотрицательные аэробные палочки (подвижные и неподвижные) и коккобациллы. В исходной попу­ляции бактерий на поверхности мяса, в том числе мяса птицы, могут присутствовать также грамположительные роды микроорга­низмов, в частности микрококки и молочнокислые бактерии, ко­торые в анаэробных условиях хранения (в вакуумной упаковке) могут стать доминирующими микроорга­низмами порчи.

Известно, что значение pH «свежего мяса» – от 5,1 до 5,9, в нем содержится достаточное количество глюкозы, других углеводов и низкомолекулярных соединений для размножения популяции бактерий.

Быстрее всего размножаются псевдомонады, которые утилизи­руют глюкозу при температурах холодного хранения. При органолептической порче мяса сначала может ощущаться слабый «мо­лочный» запах, а при исчерпании запаса простых углеводов и других низкомолекулярных соединений появляются характерные запахи: тошнотворно-сладкий запах разложения и гнилостный.

В результате микробиологической порчи продукта из мяса его поверхность из-за размножения бактерий становится липкой. При истощении запасов глюкозы в поверхнос­тном слое мяса бак­терии порчи начинают последовательно утилизировать другие суб­страты. Метаболизм азотистых соединений и приводит к продуци­рованию различных дур­но пахнущих соединений – аммиака, аминов, диметилсульфида (ДМС) и сероводорода.

Практически все исследования, касающиеся порчи мяса и птицы, за последние примерно 50 лет рассматривают продукты, хранящиеся при низкой температуре.

Обнаружено, что порчу цельномышечной говядины, хранив­шейся в различных услови­ях, вызывают следующие виды грибов: Thamnidium, Mucor и Rhizopus, которые прояв­ляются на мясе в виде «нитевидных усиков». Cladosporium образует «черные пятна», Penicillium – зеленую плесень, a Sporotrichum и Chrysosporium – «белые пятна». Боль­шинство грибов не растет на мясе, если темпе­ратура его хранения ниже 5°С.

Среди родов дрожжей, найденных в говядине, хранившейся при температурах холо­дильника, можно выделить Candida и Rhodotorulla, причем наиболее распространены в испортившемся говяжьем фарше виды С. lipolytica и С. zeylanoides. Говяжий фарш и мясо для гамбургеров портят исключительно бактерии. Это происходит под действием микро­организмов, относящихся к родам Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Moraxella и Aeromonas. Наиболее важную роль в порче мяса играют Pseudomonas и Acinetobacter-Moraxella spp.

Обнаружено, что Pseudomonas spp. – доминирующий вид бак­терий при развитии порчи охлажденного мяса и птицы. Род Pseudomonas относится к гамма-подклассу Proteobacteria и включает в себя Р. fluorescence, P. fragi, типовые виды P. aeruginosa и др.

Из 231 полярно жгутиковой аэробной грамотрицательной бак­терии, выделенных из говядины, баранины, свинины и колбасного фарша, все палочки – псевдомонады, а из 110 неподвижных орга­низмов 61 представлен Moraxella и 49 – Acinetobacter.

Глубокой порче часто подвергаются бедренные части говяжьих туш и четвертины, обычно около кости, особенно крестцовой. Этот вид порчи часто называют порчей мяса у кости или закисанием. Причина этой порчи – бактерии, относящиеся к родам Clostridium и Enterococcus.

В только что изготовленном говяжьем фарше было обнаружено более 80% микробной популяции, состоящей из хромогенных бак­терий, плесеней, дрожжей и спорообразующих бактерий. Однако после порчи были найдены только короткие нехромогенные грам­отрицательные палочки. Некоторые бактерии, встречающиеся в свежем мясе, могут расти на культуральных средах при низких температурах. Однако они, очевидно, не могут успешно конкури­ровать с Pseudomonas и Moraxella-Acinetobacter.

Стейки и ростбифы подвержены поверхностной порче, причем тип заражения (плесневое или бактериальное) зависит от влаж­ности. Нарезанное мясо, хранящееся в холодильнике в условиях высокой влажности, неизменно подвергается бактериальной кон­таминации. Существенной особенностью такой контаминации яв­ляется поверхностная слизь, в которой могут находиться болезне­творные микроорганизмы. Относительно высокий ОВП, харак­терный для высокой влажности, а также низкая температура благо­приятствуют росту псевдомонад. Иногда удается различить отдельные бактериальные колонии на поверхности говяжьих ку­сков, особенно когда уровень контаминации низкий. Слой слизи получается в результате соединения (слияния) поверхностных ко­лоний и в значительной степени является причиной липкой конси­стенции испорченного мяса.

Запах может быть обнаружен, когда число бактерий достигает log₁₀ 7,0 и log₁₀ 7,5/см², далее, когда количество микроорганизмов на поверхности находится в пределах от log₁₀ 7,5 до log₁₀ 8,0/см², появляется слизь.

Плесневые грибы начинают доминировать при порче говядины при слишком сухой ее поверхности или после обработки мяса ан­тибактериальными препаратами.

Если условия благоприятствуют росту бактерий, плесень почти никогда не встречается на мясе. Бактерии растут быстрее, чем пле­сени, и потребляют весь имеющийся на поверхности мяса кис­лород, который также необходим плесеням.

Первый симптом порчи говяжьего фарша – появление запаха с последующим развитием липкости, которая указывает на присут­ствие бактериальной слизи. Слой слизи, появляющийся на свежем мясе, птице и морепродуктах по мере их порчи микро­организмами, является биопленкой.

Порча соесодержащего мясного фарша протекает быстрее, чем порча чистого мясного фарша.

 

7.4.3. Механизм порчи мяса

Химические методы выявления порчи мяса предполагают, что, поскольку мясо подвергается порче, некоторые годные для исполь­зования вещества потребляются, а некоторый новый продукт или продукты образуются микробиотой порчи. Порча мяса при низкой температуре сопровождается выработкой бесцветных соединений, таких как аммиак, сероводород, индол и амины. Недостатком ме­тодик определения порчи мяса является то, что не все микроорга­низмы порчи одинаково способны синтезировать указанные ве­щества. Все физические и прямые бактериологические методы имеют тенденцию показывать очевидное: мясо, которое явно ис­порчено с точки зрения органолептических характеристик (запах, вид, текстура и вкус), действительно испорчено. Они не позволяют предсказать порчу или срок годности, чему должен в идеале соот­ветствовать тест на свежесть мяса.

Индикаторами порчи мяса можно назвать диамины, кадаверин и путресцин. Образование диаминов происходит следующим образом:

Было исследовано их использование как индикаторов при опре­делении качества говядины, упакованной в вакууме, при темпера­туре хранения 1°С в течение 8 недель. В вакуумно упакованном мясе содержание кадаверина увеличивалось больше, чем содер­жание путресцина, а в аэробно хранившемся мясе было обнару­жено обратное. Уровень кадаверина, измеренный после инкубационного периода, был в 10 раз выше начального уровня при общем числе жизнеспособных микроорганизмов 10/см², тогда как уровень путресцина изменился незначительно. Таким образом, полученные данные указывают на ценность использования этих диаминов для оценки мяса, упакованного в вакууме. В свежей говядине, свинине и баранине путресцин находится на уровне от 0,4 до 2,3 ppm, када­верин – от 0,1 до 1,3 ppm. Путресцин – главный диамин, выраба­тываемый псевдо­монадами, тогда как кадаверин больше вырабаты­вается бактериями Enterobacteriaceae. Как показывают исследо­вания, содержание путресцина увеличивается с 1,2 до 26,1 ppm в естественно обсемененной говядине, хранившейся при темпера­туре 5°С в течение 4 сут; уровень кадаверина значительно ниже. Со­гласно другому исследованию уровень обоих диаминов увеличи­вался одинаково при равных условиях. В одной из работ показано, что изменение уровня гистамина и тирамина в говядине и свинине было слишком незна­чительным для оценки порчи мяса, но когда порча произошла, уровень путресцина в говядине и кадаверина в свинине сильно изменился.

Показано, что техника определения экстрактивных веществ может быть использована для определения порчи мяса и предска­зания времени его хранения в холодильнике. Техника основана на определении объема водного экстракта, высвобожденного гомо­генизированной говядиной при фильтрации через бумагу за опре­деленный период времени. Использование этого метода показы­вает, что говядина хорошего органо­леп­тического и микробиологи­ческого качества высвобождает больше экстрактивных веществ по сравнению с мясом плохого качества.

Метод ОВЭ (объем выделяемого экстракта) выявляет два ас­пекта механизма порчи. Во-первых, низкотемпературная порча мяса происходит без значительного разрушения первичных белков, во всяком случае без их полного разрушения. Хотя этот факт был подтвержден анализом суммарного белка в образцах свежего и ис­порченного мяса, он также подтверждается результатами самого метода; т.е. поскольку мясо подвергается микробной порче, ОВЭ уменьшается, а не увеличивается, как было бы в случае полного гидролиза белков. Во-вторых, обнаруживается увеличение гидра­тации белков мяса в результате некоторого пока неизвестного ме­ханизма, хотя было показано, что к этому имеют отношение аминосахаридные комплексы, вырабатываемые микробиотой порчи. Так как полного разрушения белков не происходит, возникает вопрос: откуда бактерии берут вещества, необходимые для их жиз­недеятельности?

При хранении свежего мяса при низкой температуре бактерии, которые могут существовать в таких условиях, начинают размно­жаться. В свежем мясе с pH около 5,6 содержатся глюкоза и угле­воды в количестве, достаточном для поддержания концен­трации около 10⁸ кл/см². Среди гетерогенной микробиоты свежего мяса псевдомонады растут быстрее всего и потребляют при низкой темпе­ратуре глюкозу и кислород. Brochothrix termosphacta также потребляет глюкозу и глутамат, но из-за низкой скорости роста эти бактерии не могут конкурировать с псевдомонадами. При достижении поверх­ностной популяцией концентрации, равной 10⁸ кл/см², источник углеводов иссякает, однако запах на этой стадии еще может не про­явиться – все зависит от степени использования свободных амино­кислот. После того как все углеводы иссякнут, псевдо­монады вместе с другими грамотрицательными психрофилами, такими как Moraxella, Álcaligenes, Aeromonas, Serratia и Pantoea, утилизируют свободные аминокислоты и другие простые азотистые соединения для получения энергии. Acinetobacter spp. утилизирует прежде всего аминокислоты, потом – лактат, а их рост замедляется при pH 5,7 и ниже. В случае с мясом птицы преобразование глюкозы в глу­тамат дает конкурентное преимущество псевдомонадам.

Различные исследования мясного сока баранины (pH 6,0 и тем­пература 4°С) позволили установить, что P. buorescens более распро­странен на свежей баранине по сравнению с Р. fragi, но со временем последний становится доминирующим.

Распад аминокислот и подобных соединений (сероводород образуется из серосодержащих аминокислот, NH₃ – из различных аминокислот, а индол – из трипто­фана) приводит к появлению не­приятного запаха и вкуса. Было показано, что антигенность солерастворимых белков говядины не разрушается при обычных условиях низкотемпературной порчи.

В начале порчи повышается уровень pH, увеличивается число бактерий и повышается гидратация белков. В говяжьем фарше уро­вень pH может подняться до уровня испорченного мяса – 8,5 (ис­ходное – 6,5). Фаза снижения роста может быть объяснена исчер­панием усваиваемых большинством микробиоты веществ и нако­плением токсичных побочных продуктов бактериального метаболизма. Точный же механизм разрушения белков при низкой температуре исследован недостаточно.

Микробиота порчи красного мяса. В красном мясе чаще обнару­живают грамотрицательные бактерии следующих родов: Acineto­bacter, Aeromonas, Alcaligenes, Campylobacter, Escherichia, Moraxella, Micrococcus, Psychrobacter, Pseudomonas. Из грамположительных нередко выявляют представителей родов Brochothrix, Corynebacterium, Enterococcus, Leuconostoc, Staphylococcus. В красном мясе чаще всего встречаются плесневые грибы родов Cladosporium, Geotrichum, Mucor, Rhizopus и дрожжи родов Candida, Torulopsis.

Исследование 255 образцов свинины показало наличие в мясе 247 проб (97%) энтеро­кокков, 54% которых принадлежало виду Enterococcus faecalis, 38% – виду E. faecium.

Измельченное мясо содержит больше микроорганизмов, чем мясо в тушах, полутушах, четвертях. Причинами этого служат сле­дующие факторы.

Мясной фарш готовят из обрезков, полученных от разных ку­сков. Куски часто берут в руки, на поверхности которых содер­жится большое количество микробных контаминантов.

Увеличение площади поверхности мяса при разделке на куски способствует росту микробиоты, т.е. развитию микробной порчи.

Волчки для мяса, ножи и тара для хранения на промышленных предприятиях не всегда подвергаются чистке так тщательно, как это необходимо для обеспечения успешного предупреждения раз­вития микробной порчи.

Микробиота порчи свежей птицы. В потрошеной птице число бактерий ниже, чем в цельной. В таких продуктах большинство ми­кроорганизмов сосредоточено на поверхно­сти, поэтому количество бактерий на поверхности тушек имеет большее значение по срав­нению с их количеством во внешних слоях и внутри тканей. Иссле­дование куриных тушек на шести различных коммерческих фа­бриках показало, что начальная обсемененность составляла в среднем log₁₀ 3,3 КОЕ/см². После разделки кур обсемененность увеличилась до log₁₀ 3,81, а после упаковки – до log₁₀ 4,08. На кон­вейере на птице обнаруживали
log₁₀ 4,76 КОЕ/см² бактерий.

Реже по сравнению с сальмонеллой в продуктах из индейки на­ходили Campylobacter jejuni. По результатам исследований оплодот­воренные яйца индейки и вылупившиеся индюшата не содержали этих микроорганизмов. Через две недели после вылупления ин­дюшат в брудерных птичниках 76% фекальных образцов были об­семенены этими микро­организмами.

Исследования различных продуктов из птицы показали, что по­луфабрикаты из индейки (рулеты) содержат относительно не­большое количество бактерий всех типов. При исследовании 118 образцов готовых продуктов из бройлеров С. perfringens был найден в 2,6% из них. Исследование куриных тушек в Аргентине показало, что 7 из 70 содержали Yersinia spp., включая Y. enterocolitica и Y. frederiksenii (4,3% каждого микро­организма), и Y. intermedia (1,4%). Все выделенные Y. enterocolitica принадлежали к биогруппе 1А, серотипу 0:5 и фаготипу Хг. В продуктах из птицы часто встречаются энтеро­кокки. Из 227 образцов индейки, исследованных в штате Айова в 2001–2002 гг., 226 содержали эти организмы, причем 60% выде­ленных бактерий были идентифицированы как E. faecium и 31% – как Е. faecalis. Из 236 образцов кур 234 показали наличие микроор­ганизмов, из которых 79% принадлежали Е. faecium и 16% – Е. faecalis.

Исследования изменения состава кишечных бактерий на раз­личных этапах холодильной обработки птицы показали, что на тушке до охлаждения число микроорга­низмов составляло: log_I0 3,17КОЕ/см² АПК и log₁₀ 2,27КОЕ/см² Enterobacteriaceae. После охлаждения 85% кишечных бактерий было представлено Е. coli, но через 10 сут хранения при 4°С их число уменьшалось до 14%, тогда как число Enterobacter spp. за это же время увеличивалось с 6 до 88%. Другое исследование показало, что Micrococcus spp. был единственным самым изобилующим родом бактерий на домашней птице во время ее обработки. Количество микроорганизмов на образцах кожи с шеи было больше, чем на образцах, связанных с пером, причем как до, так и после ошпарки. Corynebacterium spp. в изобилии обнаруживались в ось-пробах воздуха убойного цеха. При исследовании 1297 тушек бройлеров в 1994–1995 гг. в США в 43% случаев был обнаружен Clostridium perfringens, в 64% – Staphylococcus aureus.

Дрожжи, растущие на тушках бройлеров при температуре 4°С в течение 14 сут, были выделены и идентифицированы, при этом как минимум семь родов были идентифи­цированы как Candida, за ними следовали Cryptococcus и Ya-rowia.

Микробиота свежей птицы, как показали многочисленные ис­следования, представлена более чем 25 родами. Преобладающие бактерии, вызывающие процесс низкотемпера­турной порчи, при­надлежат роду Pseudomonas. Исследование куриных тушек пока­зало, что из 5920 видов обнаруженных микроорганизмов псевдомо­нады составляли 30, Acinetobacter – 22,7, Flavobacterium – 13,9, Corynebacterium – 12,7, Enterobacteriaceae – 8,9%. Из обнаруженных Pseudomonas 61,8% были флуоресцирующими, а 95,2% окисляли глюкозу. Содержание Acinetobacter и других видов бактерий умень­шалось наряду с псевдомонадами.

В случае применения антибиотиков для подавления роста бак­терий грибы сильнее всего вызывают порчу птицы. Если применя­ются антибиотики, то плесень в процессе порчи начинает домини­ровать. Наиболее важные дрожжи, найденные в птице, относятся к родам Candida, Rhodotorula, Debaryomyces и Yarrowia. Особенность порчи птицы – это появление слизи на поверхности тушки или на разделанных кусках. Внутренняя полость тушки часто является источником кислого запаха. Особенно это актуально для птицы, при разделке которой внутренности оставляются внутри. Причиной порчи являются все упомянутые виды бактерий в дополнение к эн­терококкам.

Было обнаружено, что двумя доминирующими родами дрожжей, появляющимися как на свежих, так и на испорченных тушках, были Candida и Debaryomyces spp., тогда как Rhodotorula не была об­наружена на испорченных тушках. Trichosporon spp. отсутствовали на свежих тушках, но были обнаружены в 5% испорченных, тогда как 3% свежих и 11% испорченных тушек содержали Yarrowia. Два наиболее распространенных вида дрожжей, которые обнаруживали на свежей и испорченной продукции, – Candida zelanoides и De­baryomyces hansenii.

Среди бактерий, составляющих биоту свежей птицы, есть ми­кроорганизмы, проду­ци­ру­ющие сильный запах. Shewanella putrefaciens хорошо растет при 5°С и выделяет сильный запах через 7–8 сут при росте на мышечных тканях птицы. Куриная груд­ка пор­тится по-другому, чем куриная ножка, потому что последняя имеет более высо­кий pH. При хранении куриных ножек при 2°С в течение 16 сут образуется микробиота, состоящая из 79% псевдомонад, 17% Acinetobacter-Moraxella и 4% S. putrefaciens. Все вы­де­лен­ные в по­следнем случае культуры продуцируют сульфидоподобные арома­тические вещества, H₂S, метилмеркаптан и диметилсульфид. Они не имели значения при порче куриных грудок.

При разделке птицы с сохранением внутренностей микроорга­низмы проникают через стенки кишечника и попадают во вну­тренние ткани полости тушки. Состояние мяса птицы, связанное с такой порчей, известно как порча внутренностей.

Во время порчи птицы запах появляется в основном до ослизнения с образованием коло­ний, которые обнаруживаются при зна­чении log₁₀ КОЕ/см² ≈ 7,2–8,0. Ослизнение обычно возникает вскоре после появления запаха с количеством микроорганизмов
log₁₀ > 8,0 КОЕ/см². Первичный рост приурочен к поверхности мяса птицы, ткани же под кожей остаются свободными от микро­организмов некоторое время. Однако постепенно бактерии прони­кают глубоко в мышечную ткань, вызывая повышение гидратации мышеч­ных белков, как в говядине.

Существенное ограничение порчи птицы ее поверхностями свя­зано с тем, что внутренние ткани птицы, как правило, стерильны или содержат небольшое количество микроорганизмов, которые не растут при низких температурах. Микробиота порчи ограничи­вается поверхностью и локализуется там, куда она попала с водой во время обработки и разделки. Поверхность свежего мяса птицы при сохранении влажности может стать местом обитания аэробных бактерий, таких как псевдомонады. Эти микроорганизмы хорошо растут на поверхности, где они образуют колонии, которые впо­следствии покрывают всю площадь и вызывают ослизнение (био­пленку), характеризующее испорченную птицу.

Таким образом, кожа птицы является лучшим местом роста и размножения микробиоты порчи. В начальной стадии порчи по­верхность мяса птицы часто флуо­ресцирует в ультрафиолетовом свете из-за большого количества флуоресцирующих псевдо­монад. Бактерии, вызывающие порчу мяса птицы, можно наблюдать в виде слизи на его поверхности, но еще лучше они видны, если пригото­вить мазок на предметном стекле. Окраска по Граму не позволяет различать перечисленные микроорганизмы. Для определения ми­кробной активности на поверхности мяса птицы может быть ис­пользован тетразолий (2,3,5-трифенилтетразолиумхлорид). Потро­шеные тушки опрыскивают этим веществом, при этом в областях высокой микробной активности появляется красная окраска. Эти области включают в себя главным образом поверхности разреза мышц, а также другие поврежденные области, в том числе воло­сяные сумки. Когда со свежих тушек снимают кожу, мышцы ножек более подвержены микробной порче, чем грудные мышцы, так как у первых значение рН, как правило, составляет 6,3–6,6, а у по­следних имеет более низкие пределы – 5,7–5,9. Когда порча мяса птицы происходит при 1°С, псевдомонады доминируют, а при тем­пературе 10 и 15°С преобладают кишечные и другие бактерии.

В заключение надо отметить следующее. Мышечные ткани мле­копитающих после их смерти обеспечивают необходимыми для роста веществами бактерии, дрожжи и грибы. Адекватное коли­чество элементов, необходимых для роста микроорганизмов, при­сут­ствует в свежем мясе в доступной форме. При анализе испор­ченного мяса и мясо­продуктов находят только некоторые роды бактерий, дрожжей и плесеней из многих возможных, причем в большинстве случаев один или несколько найденных родов будут характеризовать порчу данного вида мясного продукта. Разно­образную микробиоту в неиспор­ченном мясе представляют микро­организмы, которые присутствуют в естес­твенной окружающей среде рассматриваемого продукта, или контаминанты, занесенные в него во время обработки, упаковки и хранения.

 

7.4.4. Микробиота порчи рыбы и морепродуктов

Рыба содержит сравнительно высокие количества белков и других азотосодержащих веществ. Природа азотосодержащих ве­ществ специфична для мяса рыбы. Не все азотистые компоненты в рыбе находятся в составе белков. Среди компонентов небелко­вого азота – свободные аминокислоты, азот летучих оснований типа аммиака и триметил­амина, креатин, таурин, бетаины, уриновая кислота, анзерин, карнозин и гистамин.

Бактериальной порче подвержена свежезамороженная рыба; со­леная и высушенная рыба с большой вероятностью подвергается порче грибами. Бактериальная микробиота испорченной рыбы со­стоит в основном из аспорогенных грамотрицательных палочек родов Pseudomonas и Moraxella-Acinetobacter, способных расти при 0 и 1°С. Особо восприимчивыми к порче частями рыбы являются жабры и слизь на внешнем наружном покрове. Слизь состоит из мукополисахаридных веществ, свободных аминокислот, оксида триметиламина, производных пиперидина и других подобных ве­ществ. Ранние признаки органолептической порчи могут быть за­мечены при исследовании жабр на посторонний запах.

Если не проводить своевременного потрошения рыбы, ки­шечные бактерии быстро проникают через кишечные стенки в ткани кишечной полости. Этому процессу, как полагают, способ­ствует действие протеолитических ферментов, представленных пи­щеварительными ферментами рыбы, или бактериальными фермен­тами кишечной микрофлоры рыбы, или теми и другими вместе. Общее количество микроорганизмов на поверхности рыбы опре­деляют числом микроорганизмов, выраженных на 1 см². Исследо­вания проводят путем посева на чашках Петри.

Микроорганизмы порчи сначала используют простые вещества, образуя различные летучие дурно пахнущие соединения. В про­цессе порчи рыбы с образованием триметил­амина, аммиака, гистамина, сероводорода, индола и других веществ исчезают оксид три­метиламина, креатин, таурин, анзерин и т.п. Мясо рыбы подверга­ется автолизу быстрее, чем мясо млекопитающих, при общем отсутствии полного протеолиза. Автолиз наряду с микробной порчей, как полагают некоторые исследователи, ускоряет процесс порчи, в частности микробной, а разграничить эти процессы трудно. При детальном изучении причин типичной порчи рыбы установлено, что микробные контаминанты принадлежат к родам Pseudomonas и Acinetobacter-Moraxella.

Согласно исследованиям, 159 штаммов грамотрицательных бак­терий, выделенных из испорченной пресноводной рыбы, обсемененной общей аэробной микробиотой в количестве 10⁸ КОЕ/г, 46% микробиоты составляли псевдомонады и 38% – Shewanella spp. По­следний микроорганизм производит H₂S и восстанавливает триметиламин-N-оксид. Как предполагают, он является основной бакте­рией, вызывающей порчу рыбы.

При исследовании микрофлоры кожи рыб обнаружены сле­дующие микроорганизмы: Pseudomonas-Alteromonas — 32–60%, Moraxella-Acinetobacter — 18–37%. Начальная микробиота филе сельди представлена S. putrefaciens и псевдомонадами. После порчи при доступе воздуха эти микроорганизмы составили 62–95% мик­рофлоры. При порче в атмосфере 100% СO₂ при 4°С в филе сельди почти полностью доминировали лактобациллы. В филе каменного окуня, хранившегося в атмосфере, состоящей из 80% СO₂ и 20% воздуха, при 4°С в течение 21 сут, микробиота на 71–87% состояла из лактобацилл. Исследования психрофильных Enterobacteriaceae, выделенных из упакован­ного под вакуумом и в атмосфере СO₂ ло­сося холодного копчения, показали, что преобла­дали виды Pantoea agglomérons и Serratia liquefaciens. Число Enterobacteriaceae, обнару­женных в испорченных изделиях, находилось в диапазоне от 10³ до 1,2 · 10⁷/г, но их роль в процессе порчи неясна. В средиземно­морском леще, хранившемся в аэробных условиях и в модифици­рованной атмосфере, в процессе аэробной порчи участвовали два домини­рующих вида – Pseudomonas lundensis и P. fluorescens. В ис­порченной морской рыбе различных видов часто обнаруживают Photobacterium phosphoreum.

Микробиотная порча мяса ракообразных подобна порче мяса рыбы. У ракообразных порча начинается с внешней поверхности. Мышцы ракообразных содержат более 300 мг азота/100 г мяса, что значительно выше, чем у рыбы. Присутствие повышенных коли­честв свободных аминокислот и азотистых экстрактивных веществ в мясе ракообразных делает их весьма восприимчивыми к быстрому развитию бактерий, вызывающих порчу. Началь­ная порча мяса ра­кообразных во многом схожа с таковой мяса рыбы. Микробная порча креветок сопровождается увеличенной гидратацией, свой­ственной мясу или домашней птице.

Микробиота моллюска находится в прямой зависимости от ка­чества воды, из которой он выловлен, качества промывочных вод и других факторов. В испорченных устрицах обнаружены сле­дующие роды бактерий: Serratia, Pseudomonas, Proteus, Clostridium, Bacillus, Escherichia, Enterobacter, Pseudoalteromonas, Shewanella, Lactobacillus, Flavo­bacterium и Micrococcus. Поскольку порча развива­ется и прогрессирует, Pseudomonas и Acinetobacter-Moraxella spp. преобладают наряду с энтерококками, лактобациллами и дрожжами, доминирующими на последней стадии порчи.

Измерение рН, очевидно, – более объективный тест, опреде­ляющий порчу устриц и других моллюсков, чем измерение азота летучих оснований.

Хотя рН расценен многими исследователями как лучшая объек­тивная методика определения микробного качества устриц, пока­зано, что определение органолептической характеристики и ми­кробного числа – более надежные показатели микробного качества этих изделий.

 

7.4.5. Механизм порчи рыбы и морепродуктов

Рыба, как и мясо, ввиду ее анатомического строения и биохими­ческого состава, – скоропортящийся продукт. Расположенный вдоль всего тела кишечник представляет постоянную опасность об­семенения мышечной и других тканей микроорганизмами кишеч­ника. Поверхностная слизь рыбы служит питательной средой для микроорганизмов и способствует последующему обсеменению мы­шечной ткани.

Рыхлая структура мышц, большое содержание влаги, отсутствие плотной соединительной ткани ускоряют распространение микро­организмов по телу рыб. Распространению и быстрому размно­жению микроорганизмов благоприятствует их психрофильность и высокая каталитическая активность. В том числе это касается пи­щеварительных ферментов кищечника рыбы.

Испорченная рыба выделяет дурно пахнущие вещества: индол, скатол, аммиак, сероводород.

Для длительного хранения рыбу замораживают, сохраняя ее при температуре ниже 
–12°С, или солят. В таких условиях рыба практи­чески не подвергается микробиальной порче. Для сохранения икры применяют консерванты.

При исследовании микробной порчи рыбы наблюдается восста­новление триметиламин-N-оксида (ТМАО) до триметиламина (ТМА):

ТМАО – вещество, присутствующее только в морской рыбе. В свежепойманной рыбе ТМА содержится в небольших количествах или не содержится вовсе. Поэтому считается, что присутствие ТМА в рыбе имеет микробное происхождение, хотя некоторые виды рыб содержат тканевые ферменты, которые восстанавливают ТМАО до ТМА. Не все бактерии равны по способности восстанав­ливать ТМАО до ТМА – все зависит от рН.

Методы, используемые для обнаружения ТМА, основаны на его экстракции из рыбы с последующей реакцией с пикриновой кис­лотой. Для обнаружения ТМА используют газовую хроматографию.

Определение СO₂ с использованием инфракрасного СO₂-анализатора используется в качестве быстрого метода обнаружения порчи в охлажденной рыбе. Результаты этого нового метода детекции СO₂ хорошо коррелируют с данными АПК.

Гистамин, диамины и сумма летучих веществ также использу­ются как индикаторы порчи рыбы. Гистамин производится ми­кробной гистидиндекарбоксилазой из амино­кислоты гистидина. Гистамин связан с отравлением рыбой семейства скумбриевых. Ка­даверин и путресцин – наиболее важные диамины, рассматри­ваемые как индикаторы порчи, они используются для рыбы так же, как для мяса и домашней птицы.

Известно, что тирамин производится такими микроорганиз­мами, как Carnobacterium pise cola и Weissella viridescens, выделен­ными из упакованной под вакуумом посоленной с добавлением сахара рыбы.

Наиболее важное различие в химическом составе между рако­образным и моллюском – более высокое содержание углеводов в последнем. Например, мясо гребешка содержит 3,4% углеводов, а устрицы – 5,6%, главным образом в виде гликогена. Высокое со­держание углеводов в моллюсках является причиной различных видов порчи этих пищевых продуктов.

Гликоген моллюсков утилизируется микроорганизмами порчи. В мясе моллюсков также много азотистых оснований. В их мы­шечной ткани наблюдается более высокое содержание свободных аспаргиновой и глутаминовой кислот, чем в рыбе.

Контрольные вопросы и задания

1. Опишите типы и механизмы микробиологической порчи пищевых продуктов. Дайте определение порче пищевых продуктов.
2. Назовите индикаторы порчи пищевых продуктов. Изложите методы идентификации микробиоты порчи: молекулярно-генетические, ми­кроскопические и биосенсорные.
3. Поясните сущность индикации и идентификации дрожжей, вызы­вающих порчу пищевых продуктов.
4. Опишите методики определения количества дрожжей в пищевых про­дуктах.
5. Изложите методику идентификации дрожжей, основанную на опи­сании их филогенетических свойств.
6. Поясните сущность индикации и идентификации плесеней, вызы­вающих порчу пищевых продуктов.
7. Изложите методы определения количества плесневых грибов в пи­щевых продуктах: метод посева, метод фильтрации, метод подсчета гифов.
8. Раскройте сущность и опишите микроскопический метод идентифи­кации плесеней.
9. В чем сущность микробиологической опасности, связанной с порчей пищевых продуктов сапрофитной микробиотой?
10. Раскройте механизмы микробиологической порчи молока. Опишите микробиоту порчи молочных продуктов; гнилостные бактерии, аэробные спорообразующие бактерии, аэробные неспорообразующие бактерии, факультативно-анаэробные неспорообразующие бактерии, анаэробные спорообразующие палочки, энтерококки, маслянокислые бактерии, термо­устой­чивые лактобациллы, мицелиальные грибы.
11. Изложите сущность методов оценки качества молока – методов по­сева, подсчета колоний с предварительной инкубацией, подсчета ко­лоний после лабораторной пастеризации, подсчета колиформ.
12. Опишите микрофлору молока после обработки.
13. Охарактеризуйте микробиологическую порчу сыров, кисломолочных продуктов, сливок, сливочного масла.
14. Изложите технологические приемы получения и переработки молока, используемые для предотвращения его порчи.
15. Охарактеризуйте способы термической обработки молока.
16. Раскройте сущность новых современных технологий обеззараживания молока.
17. Что влияет на численный и видовой состав микробиоты красного мяса и мяса птицы?
18. Какие группы и виды микробиоты могут преобладать в мясе при его порче?
19. Опишите механизмы порчи мяса микробиотой.
20. Каково распространение микробиоты в красном мясе и в мясе птицы?
21. Опишите микрофлору порчи мяса.
22. Опишите микрофлору порчи птицы.
23. Раскройте механизмы порчи сырья и пищевых продуктов микроорга­низмами.