В пивоваренном производстве микробиологическому контролю подлежат:

• ячмень, солод, несоложенные материалы;
• вода;
• дрожжи семенные и чистая культура дрожжей (ЧКД);
• сусло;
• бродящее пиво;
• готовое пиво до и после фильтрации;
• пиво до и после пастеризации;
• упакованное готовое пиво в день розлива и через 10 дней хране­ния;
• смывы и мазки для определения качества мойки и дезинфек­ции;
• тара;
• укупорочные материалы;
• технологическое оборудование, коммуникации, моющие ре­агенты;
• воздух производственных помещений и воздух, подаваемый на аэрацию сусла, углекислый газ.

Для каждого анализа разрабатывается и устанавливается своя про­грамма отбора проб:

• точка отбора;
• объем пробы;
• периодичность отбора;
• показатели и методы анализа;
• допустимое количество микроорганизмов.

При отборе проб для микробиологического анализа необходи­мо соблюдение условий, исключающих вторичную контаминацию посторонними микроорганизмами. Отбор проб следует проводить только в стерильные емкости и непосредственно перед анализом. В случае необходимости исследуемые пробы хранят в холодиль­нике не более 2 ч.

Отбор проб из закрытых емкостей:

• слить определенное количество среды, открыв кран и затем за­крыв его;
• промыть спиртом отверстие крана снаружи и внутри;
• обработать пламенем;
• промыть спиртом отвод (колено трубы) или спираль (при высо­ком внутреннем давлении танка) и привинтить;
• обработать пламенем;
• снова слить определенное количество среды, открыв и закрыв кран;
• открыть пробную бутылку и под воздействием пламени взять пробу;
• закрыть пробную бутылку под воздействием пламени на гор­лышко и затворный конус;
• закрыть пробный кран.

Правила пользования микробиологическим клапаном «Кеофитт» для отбора проб:

1. Микробиологический кран «Кеофитт» имеет два выхода (рис. 18), которые должны быть закрыты плотно надевающимися металличе­скими или резиновыми заглушками.
2. Краны должны быть постоянно залиты спиртом.
3. Для отбора проб из крана необходимо иметь емкость с 70%-ным раствором спирта.
   
   
4. 

Рис. 18. Асептический пробоотборный клапан «Кеофитт»

Принцип действия клапана «Кеофитт» представлен на рис. 19.

 Рис. 19. Принцип действия клапана «Кеофитт»: а – клапан открыт, отбор пробы; б – клапан закрыт, стерилизация

Порядок отбора проб:

1. Снять пробку с нижнего выхода крана.
2. Осторожно открыть кран, вращая барашек только в соответству­ющем направлении.
3. Первую порцию жидкости слить, чтобы удалить спирт из крана.
4. Произвести отбор пробы в стерильную емкость.
5. Кран закрыть, промыть его спиртом, чтобы смыть остатки пива.
6. Надеть заглушку на нижний выход крана, через верхний выход залить спиртом весь свободный объем крана.
7. Закрыть заглушкой верхний выход, чтобы спирт не испарялся.

Отбор проб с поверхностей предназначен: для контроля мойки внут­ренних стен чанов и емкостей (танков); внутренних стен трубопрово­дов, шлангов; внешних поверхностей блоков розлива и укупорщиков бутылок; внешних поверхностей блоков розлива в кеги; шпунтован­ных соединений; зон за снятыми уплотнениями; при смене танков и т.д.

Отбор проб с мелких твердых тел (например, с кронен-пробок) производят путем их погружения в стерильную емкость с широким горлышком, заполняют стерильным физиологическим раствором (0,9%-ный раствор хлорида натрия). Затем этот физраствор подвер­гается мембранной фильтрации.

Отбор проб с бутылок и кег производят следующим образом. Для контроля качества мойки бутылки и кеги промываются стерильным физиологическим раствором, в который может добавляться Твин 80 (1 см³/дм³). Затем промывная жидкость подвергается мембранной фильтрации.

Ячмень, солод, хмель, ферменты, сахарный сироп, несоложенные ма­териалы. Пиво должно вырабатываться из доброкачественного сырья, отвечающего требованиям ГОСТов, ТУ. Зерно считается хорошим, если общее количество колониеобразующих единиц составляет менее 10⁵/г. Ячмень, солод и несоложенные материалы анализируются при поступлении на завод и по мере необходимости.

Сахароза, сахарный сироп, мальтозная патока часто являются источником мезофильных аэробных бактерий, диких дрожжей, спор мицелиальных грибов, а также слизеобразующих бактерий p. Leuconostoc. Содержание перечисленных организмов в 10 г сахара должно отсутствовать.

Используемые в пивоварении ферментные препараты могут быть источниками контаминации бактериями родов Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, уксуснокислыми, молочнокислыми бактериями и должны иметь микробную обсемененность не более 10⁴ КОЕ/1 г (см³) фер­ментного препарата. Наиболее опасны для пивоварения молочнокис­лые, уксуснокислые бактерии и дикие дрожжи, а также строго анаэ­робные бактерии p. Pectinatus и p. Megasphaera.

Прессованные хмелевые шишки могут содержать споры мицелиальных грибов р. Neurospora, Alternaria, Pénicillium, Aspergillus. Разные виды хмеля (шишки, порошок, гранулы, экстракт) могут быть обсе­менены бактериями p. Erwinia, Pseudomonus, Lactobacillus, Pediococcus, Klebsiella и спорами плесневых грибов.

Вода. При производстве пива используют воду, бактериологиче­ские требования к которой должны соответствовать требованиям СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода и водоснабжение населенных мест: Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды цент­рализованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

Точки микробиологического контроля воды на заводе:

• городская или колодезная вода;
• вода после водоподготовки;
• вода после дозировки диоксида хлора при дополнительной об­работке;
• деаэрированная вода;
• технологическая вода и последние смывные воды;
• вода на ополаскивание в ринзере и бутылкомоечная машина (БММ);
• вода на впрыск.

Пробу воды для санитарно-микробиологического анализа отби­рают в производственных помещениях и транспортируют согласно МУК 4.2.1018-01. Микробиологический контроль воды проводят не реже 1 раза в месяц. Чаще всего предприятия, разрабатывая свои схемы контроля, на отдельных этапах рекомендуют исследовать воду 1 раз в неделю или ежедневно. Вода на всех стадиях производства анали­зируется на разные показатели: общее микробное число, БГКП, дрожжи, плесневые грибы, молочнокислые бактерии. В воде до­пускается 0–50 клеток/см³ в зависимости от места отбора пробы, а в 100 см³ воды БГКП должны отсутствовать. Вода для пивоварения и промывная вода анализируются в количестве 100–500 см³ методом мембранной фильтрации.

Чистая культура и семенные дрожжи. Оценка качества дрожжей предполагает систематический микробиологический контроль за чистотой производственной культуры, условиями ее хранения, разве­дения и т. д. Состояние дрожжевой культуры не только определяет ка­чество пива, но и обусловливает скорость главного брожения.

Очень часто семенные дрожжи контаминируют энтеробактерии, уксуснокислые (p. Gluconobacter и p. Acetobacter) и молочнокислые (p. Pediococcus и p. Lactobacillus) бактерии, дикие дрожжи, относящиеся к p. Saccharomycetes (S. cerevisiae var. diastaticus; S. cerevisiae var. ellipsoideus), а также Obesumbacterium proteus и бактерии p. Hafnia. Посторонние мик­роорганизмы в производственной культуре выявляют путем высева на различные питательные среды, дальнейшего микроскопирования и проведения дополнительных идентификационных тестов.

Микробиологический контроль производственной культуры кроме проверки биологической чистоты включает также определение ее фи­зиологического состояния, биохимической активности, наличия про­изводственно-ценных свойств, скорости размножения и т. п.

Определение количества мертвых клеток является неотъемлемой частью оценки состояния культуры дрожжей. Целесообразнее не ис­пользовать дрожжи с повышенным количеством мертвых клеток, чем вносить изменения в технологический процесс.

Семенные дрожжи, контаминированные дикими дрожжами, не­обходимо утилизировать, т. к. избавиться от них невозможно, а зара­жение при последующих циклах будет только усиливаться.

Все штаммы дрожжей, которые не используются в производстве пива, рассматриваются в качестве диких. Дикие дрожжи делятся на две группы: дрожжи, относящиеся к p. Saccharomyces (S. diastaticus, S. ellipsoideus), и дрожжи, не относящиеся к p. Saccharomyces (Candida tropicalis, Debaromyces, Pichia membranaefaciens, Hansenula anomala, Rhodotorula rubra, Torulopsis glabrata, Schizosacharomyces pombe и др.). Дрожжи верхового брожения также являются дикими, если в техно­логии используются дрожжи низового брожения.

Дифференцирование дрожжей среди других культур проводят пу­тем посева образца на селективные питательные среды:

• рост на лизиновом агаре или агаре с сульфатом меди (2–5 сут, 24–25°С) позволяет выявить чужеродные дрожжи, не относя­щиеся к p. Saccharomyces;
• рост на кристалвиолетовом агаре или среде LWYM (2–5 сут, 24–25°С) позволяет выявить чужеродные дрожжи, относящи­еся к
• рост на сусловом агаре (WA) 2 сут при 37°С позволяет выявить культурные дрожжи верхового брожения и дикие дрожжи, от­носящиеся и не относящиеся к р. Saccharomyces;
•     рост в окончательно сброженном пиве (3–4 сут, 28°С) по­зволяет выявить «сверхсбраживаемые» дрожжи Saccharomyces diastaticus.

Выявление и идентификация диких дрожжей среди дрожжей низового брожения. Пробу дрожжей низового брожения (задаточные дрожжи, съемные дрожжи, дрожжи на дображивание) суспендируют в стериль­ной воде и делают посев на плотные (твердые) питательные среды для дифференцирования дрожжей:

• дрожжи, не относящиеся к Посев проводят на питательную среду с добавлением сульфата меди (агар Тейлора) или на лизиновый агар;
• дикие дрожжи, относящиеся к Анализируют рост на кристалвиолетовом агаре;
• дрожжи верхового брожения и другие дикие дрожжи выявляют посевом на сусловой агар
• дрожжи, обладающие высокой бродильной активностью, на­пример Saccharomyces diastaticus, дают рост в окончательно сброженном пиве.

Выявление и идентификация диких дрожжей среди дрожжей вер­хового брожения. Пробу дрожжей верхового брожения (задаточные дрожжи, съемные дрожжи, дрожжи из танка дображивания) высе­вают на плотные (твердые) питательные среды для дифференцирова­ния дрожжей:

• дрожжи, не относящиеся к выявляют посевом на УМ агар с добавлением сульфата меди (агар Тейлора) или на лизиновый агар;
• рост на кристалвиолетовом агаре дают дикие дрожжи, относя­щиеся к
• дрожжи низового брожения и другие дикие дрожжи выявляют посевом на пантотеновый агар (2-4 сут культивирования при 28°С) или на мелибиозовый агар (культивирование 2 сут при 28°С);
• дрожжи, обладающие высокой бродильной активностью, на­пример, Saccharomyces diastaticus, дают рост в окончательно сброженном пиве.

Обнаружение бактерий в культурных дрожжах. Микробиологиче­ский контроль с целью обнаружения бактерий-контаминантов про­водят путем высева проб культурных дрожжей на следующие пита­тельные среды:

• VLB-S7-S-быльон, VLB-S7-S-arap, NBB-агар, UBA сдобав­койАВР. При культивировании 5–7 суток при 27-30°С в ана­эробных условиях обнаруживаются представители родов Lacto­bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Megasphaera, Pectinatus, Zymomonas. При росте в бульоне происходит помутнение и подкисление среды, выпадает осадок и нарушаются органолептические характеристики;
• актидионовый агар (стандарт-1-агар, WLN-arap или UBA с до­бавлением актидиона (100 мг/см³)) используют для выделения бактерий, а также идентификации Obesumbacterium proteus, Enterobacter и актидионустойчивых дрожжей. Культивирование проводят 3 суток при 27–30°С в аэробных условиях.

В настоящее время количество мертвых клеток при съеме дрожжей не должно превышать 3–5 %. В случае получения повышенных зна­чений – более 5 % – требуется немедленное вмешательство в произ­водство, т. к. высокий процент мертвых клеток указывает на необхо­димость корректировки ряда этапов технологии.

В семенных дрожжах микроскопированием определяют «упитан­ность» или количество клеток с гликогеном. Более 75 % дрожжей должны содержать гликоген.

Пробирки с чистой культурой дрожжей до начала работы хранят на скошенном агаре закрытыми в холодильнике при температуре 4–5 ºС не более 3 мес. При разведении культуры клетки дрожжей бактерио­логической петлей переносят со скошенного сусло-агара в пробирки с суслом и инкубируют 24 ч при температуре 25ºС. Затем каждые 24 ч дрожжи переносят в сусло большего объема и инкубируют при комнатной температуре. На каждой стадии производится микробио­логический контроль, который включает определение аэробных мик­роорганизмов, молочнокислых бактерий и диких дрожжей, а также подсчет концентрации дрожжевых клеток и процент мертвых и поч­кующихся клеток. На последней стадии дрожжи помещаются в колбу Карлсберга, заполненную стерильным суслом. Концентрация дрож­жевых клеток должна быть не менее 60–80 млн/см³.

Сусло. Качественное определение микробиологической кон­таминации сусла определяют путем длительного культивирова­ния (24–72 ч) 180 см³ отстаиваемой пробы сусла при 25–28°С. Ежесуточно ведут контроль, фиксируя помутнение (образование диметилсульфида) в течение 72 ч.

Количественное определение бактерий проводят путем высева 10 см³ сусла, разведенного в 100 см³ физиологического раствора ме­тодом мембранной фильтрации, используя среду UBA для выде­ления аэробов и анаэробов. Через 72 ч инкубации при 25–28ºС определяют число колоний аэробных микроорганизмов.

Энтеробактерии определяют на средах MacConkey-arap или Эндо. В охлажденном сусле и в сусле после аэрации определяют об­щее число микроорганизмов и молочнокислые бактерии (МКБ). Сусло отбирается стерильно из крана после теплообменников еже­недельно и анализируется методом мембранной фильтрации на при­сутствие дрожжей, плесневых грибов и молочнокислых бактерий по­севом на селективные среды (сусловой агар, MRS, VLB-S7-S-arap).

Микробиологический контроль сусловарочного цеха приведен в табл. 6.

Таблица 6

Микробиологический контроль сусловарочного цеха

Сусло, используемое в лаборатории, исследуется каждый раз при разведении чистой культуры дрожжей. В 10 см³ сусла микро­организмы не допускаются. На многих предприятиях введены бо­лее жесткие нормативы – тогда количество микроорганизмов не допускается в 20 или 50 см³. Обнаружение любых диких, культур­ных дрожжей или бактерий свидетельствует о плохом санитарно-гигиеническом состоянии и потенциальных микробиологических проблемах.

Готовое пиво. Качество готового пива в настоящее время регламен­тируется действующими СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические тре­бования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

Качество и безопасность пива оцениваются по двум группам пока­зателей: химическим и микробиологическим.

Химические показатели (допустимые уровни, мг/кг, не более):

В зависимости от вида пива и сроков его хранения в продукте до­пускаются разные показатели микробиологической контаминации:

• пиво разливное, непастеризованное: БГКП в 1 см³ – не допус­каются; патогенные микроорганизмы, в том числе Salmonella в 25 см³, – не допускаются;
• пиво непастеризованное нефильтрованное и фильтрованное необеспложенное: БГКП в 3 см³ (в кегах) и в 10 см³ (в бутыл­ках) – не допускаются; патогенные микроорганизмы, в том числе Salmonella в 25 см³ – не допускаются;
• пиво пастеризованное и обеспложенное: КМАФАнМ – не более 500 КОЕ/100 см³; БГКП в 10 см³ – не допускаются; патоген­ные микроорганизмы, в том числе Salmonella в 25 см³, – не до­пускаются; дрожжи и мицелиальные грибы в 40 см³ – не до­пускаются.

В готовом пиве токсичные элементы оценивают 2 раза в год и 1 раз в год – радионуклиды.

Микробиологический контроль на отдельных этапах производства представлен в табл. 7.

Тара. Бутылки, алюминиевые банки. Бутылки (стекло или ПЭТ) и банки отбираются в количестве 3 штук после бутылкомоечной ма­шины (или ополаскивателя). Каждую ополаскивают 100 см³ стериль­ного физиологического раствора, который затем анализируется мето­дом мембранной фильтрации.

Анализ кегов. Еженедельно (в случае необходимости ежедневно при каждом наливе) с 2 кегов (наружный и внутренний круг филлера) ана­лизируют микробиологическую чистоту. Для этого обжигают головку кега газовой горелкой и наливают в кег 200 см³ стерильного физрас­твора или воды. 100 см³ смывной воды затем анализируется методом мембранной фильтрации.

Таблица 7

Микробиологический контроль отдельных этапов производства

Во всех смывах определяют общее микробное число и оценивают наличие диких дрожжей, молочнокислых бактерий. Вымытые бу­тылки не должны содержать молочнокислых бактерий и педиококков, дрожжей p. Saccharomyces и плесневых грибков.

Укупорочный материал. Кронен-пробки (10 штук) для микробиоло­гического анализа отбирают из бункера перед укупором или с транс­портера стерильным пинцетом в стерильную емкость с крышкой. Анализ микробиологической чистоты проводят не менее 2 раз в ме­сяц, чаще – еженедельно.

В лаборатории пробки ополаскиваются стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрия, который затем анализируется методом мембранной фильтрации. БГКП и другие микроорганизмы в 1 см³ ис­следуемого раствора не допускаются.

Крышки для банок анализируют в количестве 5–10. С крышек бе­рут смывы стерильным тампоном (так же можно делать смывы и с кронен-пробок). Общую обсемененность анализируют методом мем­бранной фильтрации.

Оборудование, коммуникации. Ровные гладкие поверхности мо­гут быть исследованы методом смыва с поверхности, а также пу­тем соприкосновения с питательной средой оттиска (препарат-отпечаток), который затем культивируется. При использовании метода «смыв с поверхности» лучше подходят стерильные ватные тампоны. После отбора пробы тампон вносится в бутылку со сте­рильной водой либо с физиологическим раствором или обламы­вается. Качество мойки оборудования, трубопроводов оценивают, анализируя последнюю промывную воду, которую подвергают мембранной фильтрации с последующим высевом на питатель­ные среды.

Воздух производственных помещений и воздух, подаваемый на аэра­цию дрожжей. Для определения количества микроорганизмов в воз­духе производственных помещений используют седиментационный и аспирационный методы, описанные ранее (см. предыдущую главу). Анализ проводят не менее 1 раза в месяц. Определяют общее число микроорганизмов в 1 м³ воздуха. В воздухе варочного цеха, солодовни, дрожжевого отделения пивоваренного предприятия должно быть не более 50 микроорганизмов на 100 см³.

В настоящее время на пивоваренных предприятиях состояние воз­духа для аэрации оценивают путем его пропускания в течение 30 мин через колбу со стерильной водой или солодовым суслом, содержащим 8-10% сухих веществ (СВ), с последующим посевом на плотную пи­тательную среду.

Воздух, подаваемый на аэрацию сусла, исследуется еженедельно, воздух для аэрации чистой культуры дрожжей следует оценивать при каждом разведении. Кроме того, рекомендуется два раза в месяц ис­следовать воздух, направляемый на выдув ПЭТ бутылок. В воздухе отделения чистых культур, варочного цеха определяют ОМЧ, мо­лочнокислые бактерии, дикие дрожжи, плесневые грибы. Воздух, ис­пользуемый на аэрацию, не должен содержать клеток в 1 см³, присутствие молочнокислых бактерий, плесневых грибов, посторонних дрожжей не допускается.

Возможные точки отбора проб воздуха и СО₂ представлены в табл. 8.

Таблица 8

Микробиологический контроль воздуха и СО₂

Примечание. Воздух помещения на энтеробактерии не анализируют.

Каждое пивоваренное предприятие разрабатывает свои внутри­заводские схемы микробиологического контроля производства, учи­тывая производительность завода, сезонность, частоту встречаемости посторонней микрофлоры, используемую тару и т. д.

В настоящее время микробиологический контроль охватывает все этапы технологического процесса и к микробиологическим показателям предъявляются более жесткие требования, чем не­сколько лет назад. В табл. 9, 10 и 11 представлены примеры некото­рых схем микробиологического контроля, включая мини-заводы, которые применялись ранее. Современная схема микробиологи­ческого контроля представлена в прил. 2.

Таблица 9

Схема микробиологи­ческого контроля, используемая ранее (завод 1)

Таблица 10

Схема микробиологи­ческого контроля (завод 2)

Таблица 11

Схема микробиологи­ческого контроля № 3 (мини-завод)

Примечание. Анализируемые объекты: варочный аппарат, внешняя и внутренняя поверхность ЦКТ, внутренняя поверхность шланга, пробоотборочный кран, переходник, теплообменник, воздушный фильтр, танк для горячей воды.